檬酸钠具有防止血液凝固的作用。(2)甲装臵中，B是血红蛋白溶注，则A是磷酸缓冲液；乙装臵中，C溶液的作用是洗脱血红蛋白。(3)甲装臵用于透析(粗分离)，目的是去除样品中分子量较小的杂质。用乙装臵分离蛋白质的方法叫凝胶谱法，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。(4)分离的蛋白质可经SDS——聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。
[答案] (1)运输 防止血液凝固 (2)磷酸缓部液 洗脱血红蛋白 (3)透析(粗分离) 去除样品中分子量较小的杂质 凝胶色谱法 相对分子质量的大小 ④①②③
(4)纯度鉴定
“血红蛋白的提取和分离实验”中的注意事项
(1)红细胞的洗涤：洗涤次数不能过少，否则无法除去血浆蛋白；要抵速、短时离心，否则会使白细胞等一同沉淀，达不到分离的效果。
(2)凝胶的预处理：用沸水浴法不但节约时间，而且能除去凝胶中可能带有的微生物，排除胶粒内的气泡。
(3)色谱柱的装填：装填时尽量紧密，减小颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。 (4)色谱柱成功的标志：红色区带均匀一致地移动。 [针对练习]
2．下列关于DNA和血红蛋白的提取与分离实验的叙述中，错误的是( ) A．可用蒸馏水涨破细胞的方法从猪的红细胞中提取到DNA和蛋白质 B．用不同浓度的NaCl溶液反复溶解与析出DNA可除去部分杂质 C．透析法分离蛋白质的依据是蛋白质不能通过半透膜
D．凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小来分离蛋白质的有效方法
解析：选A 猪是哺乳动物，其成熟的红细胞中无细胞核和线粒体，故不能从中提取出DNA。
考点三| PCR技术的原理及应用
1． 细胞内DNA复制与PCR技术的比较
解旋 不 同 点 酶 引物 温度 DNA解旋酶、DNA聚合酶 RNA 体内温和条件 细胞内DNA复制 在解旋酶作用下，边解旋边复制 PCR 90℃以上高温解旋，双链完全分开 Taq DNA聚合酶 DNA或RNA 高温 相 同 点 ①需提供DNA复制的模板； ②四种脱氧核苷酸为原料； ③子链延伸的方向都是从5′端到3′端 2.PCR反应的过程 (1)变性：当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链，如下图：
(2)复性：温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，如下图：
(3)延伸：温度上升到72℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链，如下图：
[典例3] 多聚酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。请回答下列有关PCR技术的基本原理及应用问题：
(1)DNA的两条链是反向平行的，通常将____________________________________ ________的末端称为5′端，当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的________开始延伸DNA链。
(2)PCR利用DNA的热变性原理解决了打开DNA双链的问题，但又导致了DNA聚合酶失活的新问题。到20世纪80年代，科学家从一种Taq细菌中分离到______________________，
它的发现和应用解决了上述问题。要将Taq细菌从其他普通的微生物中分离出来，所用的培养基叫________________________________________________________________。
(3)PCR的每次循环可以分为______________________________________________ 三步。假设在PCR反应中，只有一个DNA片段作为模板，请计算在5次循环后，反应物中大约朋________个这样的DNA片段。
(4)请用简图表示出一个DNA片段PCR反应中第二轮的产物。 (5)简述PCR技术的主要应用。
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
[解析] (1)DNA聚合酶只能把新的核苷酸加到已经存在的核酸的3′-羟基上，与DNA母链结合的引物就提供这个羟基。
(2)因PCR利用了DNA的热变性原理解决了打开DNA双链的问题，所以用于催化DNA复制过程的DNA聚合酶要具有耐高温的特性。用选择培养基可将Taq细菌从其他普通的微生物中分离出来。
(3)DNA复制时两条链均作为模板，进行半保留复制，所以复制5次后得到的子代DNA分子数为25＝32个。
(4)新合成的DNA链带有引物，而最初的模板DNA的两条链不带有引物。
(5)PCR技术可以对DNA分子进行扩增，所以可用于遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和DNA序列测定等方面。
[答案] (1)磷酸基团 3′端 (2)耐高温的TaqDNA聚合酶选择培养基 (3)变性、复性和延伸 32
(4)如图所示：
(5)遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和DNA序列测定(要求3项以上)
1．DNA分子复制的人工控制
(1)解开螺旋：在80～100 ℃时，DNA双螺旋打开，形成两条DNA单链，称为变性。 (2)恢复螺旋：在50 ℃左右时，两条DNA单链重新形成双螺旋结构，称为复性。 (3)复制条件：缓冲液、DNA模板、四种脱氧核苷酸、热稳定DNA聚合酶和两种引物。 (4)反应场所：PCR仪。 2．PCR技术中的引物
(1)含义：引物是一小段单链DNA或RNA分子。 (2)作用：为DNA聚合酶提供合成的3′端起点。 (3)种类：扩增一个DNA分子需要2种引物。 (4)数目：引物数目等于新合成的DNA子链数目。
(5)与DNA母链的关系：两种引物分别与DNA母链的3′端通过碱基互补配对结合。 [针对练习]
3．PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，下列有关PCR过程的叙述，不正确的．是
( )
A．变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键
B．复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成的 C．延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和四种核糖核苷酸 D．PCR与细胞内DNA复制相比所需要酶的最适温度较高
解析：选C PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，其延伸过程中需要DNA聚合
酶、ATP和四种脱氧核苷酸。
[课堂对点练]
题组一 酶的制备及应用
1．(2013·江苏高考)下列有关固定化酶和固定化细胞的叙述，正确的是 ( ) A．可用包埋法制备固定化酵母细胞 B．反应产物对固定化酶的活性没有影响 C．葡萄糖异构酶固定前后专一性不同
D．固定化细胞可以催化各种反应底物的一系列反应
解析：选A 本题考查酶或细胞的固定化技术，意在考查对固定化酶和固定化细胞在方法选择和催化反应等方面异同的比较辨别能力。细胞难以被吸附或结合，固定化细胞多采用包埋法，A项正确；反应产物积累能影响酶的结构，从而使酶的活性下降，B项错误；葡萄糖异构酶在固定前后专一性不变，C项错误；固定化细胞固定的是一系列的酶，可以催化一系列的反应，但不能催化各种反应底物的一系列反应，D项错误。
2．(2012·江苏高考)下列关于酶和固定化酵母细胞的研究与应用的叙述，错误的是
( )
A．从酶的固定方式看，吸附法比化学结合法对酶活性影响小 B．作为消化酶使用时，蛋白酶制剂以口服方式给药
C．尿糖试纸含有固定化的葡萄糖酶和过氧化氢酶，可以反复使用 D．将海藻酸钠凝胶珠用无菌水冲洗，目的是洗去CaCl2和杂菌
解析：选D 酶的固定方式有包埋法、化学结合法和物理吸附法，物理吸附法是利用吸附剂本身的表面张力对附近的分子产生吸附，与化学结合法相比，不会使被吸附物质的性质发生改变，所以吸附法对酶活性影响较小，A项说法正确；消化酶在人体消化道内发挥作用，蛋白酶制剂一般在最外面加上糖衣后通过口服方式给药，B项说法正确；尿糖试纸是一种由葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶和某种无色的化合物固定于滤纸上制成的酶试纸，不能反复利用，C项说法错误；制作固定化酵母细胞时，将海藻酸钠凝胶珠用无菌水冲洗的目的是洗去CaCl2和杂菌，防止凝胶珠硬度过大和杂菌污染，D项说法正确。
3．(2011·江苏高考)下列有关酶的制备和应用的叙述，正确的是( ) A．酶解法和吸水涨破法常用于制备微生物的胞内酶 B．透析、电泳和酸解等方法常用于酶的分离与纯化 C．棉织物不能使用添加纤维素酶的洗衣粉进行洗涤 D．多酶片中的胃蛋白酶位于片剂的核心层
解析：选A 酶解法可去除微生物的细胞壁，再通过吸水涨破法使细胞内的物质释放出来，提取分离其中的胞内酶；透析和电泳可用于酶的分离和纯化，但酸解会破坏酶的结构；棉织物的主要成分是纤维素，可用含纤维素酶的洗衣粉洗涤，因为纤维素酶使纤维的结构变得蓬松，从而使渗入到纤维深处的尘土和污垢能够与洗衣粉充分接触，达到更好的去污效果；多酶片中的胃蛋白酶应在片剂的糖衣外层，而片剂的核心层应是在小肠中发挥作用的胰蛋白酶等。
题组二 PCR技术与蛋白质的分离
4．(2011·广东高考)以下关于猪血红蛋白提纯的描述，不正确的是( ) ．A．洗涤红细胞时，使用生理盐水可防止红细胞破裂 B．猪成熟红细胞中缺少细胞器和细胞核，提纯时杂蛋白较少 C．血红蛋白的颜色可用于凝胶色谱法分离过程的监测
D．在凝胶色谱法分离过程中，血红蛋白比分子量较小的杂蛋白移动慢
解析：选D 生理盐水和红细胞内的溶液为等渗溶液，A正确；各种细胞器和细胞核中都含有蛋白质，所以不含有细胞器和细胞核的红细胞内，蛋白质种类较少，提纯时杂蛋白较少，B正确；血红蛋白有颜色，所以在凝胶色谱法分离过程中易分辨，可用于监测，C正确；凝胶色谱法分离蛋白质，分子量较小的易进入凝胶内部，移动速度比较慢，故血红蛋白比分子量较小的杂蛋白移动快，D错误。
5．多聚酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。PCR过程一般经历下述多次循环：95 ℃下使模板DNA变性、解链→55 ℃下复性(引物与DNA模板链结合)→72 ℃下引物链延伸(形成新的脱氧核苷酸链)。下列有关PCR过程的叙述中正确的是( )
A．变性过程中破坏的是DNA分子内碱基之间的磷酸二酯键
B．复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成的 C．延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP、四种核糖核苷酸 D．PCR与细胞内DNA复制所需要酶的最适温度是相同的
解析：选B 变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键；延伸过程中需要的原料是脱氧核糖核苷酸；PCR过程中所需的DNA聚合酶是耐高温的，与细胞内DNA复制所需酶的最适温度不相同。
6．PCR技术是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术，下图表示合成过程，请据图分析回答：