食品微生物学实验指导(新国标)(5)

化成孢子丝。孢子丝和孢子随随种属不同而呈不同的形状和色泽，以此作为放线菌的分类依据。 放线菌的菌丝很细，直径为0.2～1.2微米之间，无隔膜、分枝繁茂、成熟后呈不同的色泽。放线菌生长缓慢，菌丝分枝相互交错缠绕，形成的菌落有的质地致密干燥，有的粘着力不强为粉质结构。所以通常采用湿室插片培养方法，使放线菌的菌丝沿着培养基与盖玻片的交界处向盖玻片上生长蔓延并且附着在盖玻片上。待其生长成熟后取出盖玻片，经染色即可看到完整结构的放线菌菌落形态和菌丝、孢子丝、孢子的形态。 三、实验材料和器材： 1、菌种：放线菌斜面菌种。 2、培养基及试剂：马铃薯琼脂固体培养基、二甲苯、95％乙醇、苯酚、琼脂粉、高氏一号琼脂培养基、吕氏美兰染色液、香柏油等。 3、器材及耗材:双目显微镜、恒温培养箱、恒温干燥箱、洁净工作台、紫外线灯管、紫外线灭菌手推车、接种环、试管、酒精灯、滤纸、擦镜纸、盖玻片、载玻片、打火机、棉花、滴瓶、长塑料篓、纱布等 四、实验方法及步骤： 1、准备工作：准备一套培养皿，包扎好后于160℃灭菌2小时，灭菌后冷却后备用。 2、接种培养：在无菌操作条件下，将经加热溶解后的培养基冷至50℃后倒入培养皿中（大约20～30mL/每皿），等至完全冷却后的培养基，在将放线菌的菌悬液加至培养基上，然后将盖玻片斜插培养基中（如下图所示），置于28℃恒温培育箱中培养3天左右。 3、肉眼观察放线菌的菌落。 4、低倍镜观察放线菌的菌落形态。 5、高倍镜观察放线菌的的气生菌丝、孢子丝和孢子形态。 五、实验结果记录： 1、肉眼观察：放线菌的菌落呈 色， 气味， 质地为 。 2、绘出高倍镜观察放线菌的菌落形态图、并注明菌名、菌各部位名称及放大倍数。 第20页 共38页 3、绘出油倍镜观察放线菌的气生菌丝、孢子丝和孢子形态图、并注明菌名、菌各部位名称及放大倍数。 六、实验结果分析及问题讨论： 实验九 细菌的简单染色及显微镜油镜的使用、保养、细菌的革兰氏染色 一、实验目的与要求： 1、掌握油镜的使用保养方法。 2、掌握细菌的涂片和简单染色技术。 3、掌握细菌的革兰氏染色的原理和方法。 二、实验原理： 细菌个体很小，在高倍镜下也看不清楚，需放大一千倍以上才能观察其形态，故要使用油镜头观察。油镜头是在使用时，在物镜与标本之间加一种折射率与玻璃折射率几乎相等的香柏油作为介质，以达到所需的放大倍数。 细菌细胞小而透明，含水量较高，在油镜下观察细胞几乎与背景无反差，所以观察细菌的形态结构，必须对它们进行染色，以便于刚观察。因细菌的蛋白质等电点较低，其生长在碱性和中性溶液中细胞带负电荷，所以通常用碱性染料（如美兰、结晶紫、复红、孔雀绿）使其细胞着色。 革兰氏染色法可将细菌氏分别革兰氏阳性菌（G）和革兰氏阴性菌（G）两大类，是细菌学上最常用的鉴别性染色法。 革兰氏染色是使用几种不同的染料对细菌进行染色。先进草酸结晶紫初染，次经碘液媒染，再用95%酒精脱色处理，最后用蕃红液复染。如果细菌能保持结晶紫—碘复合物的颜色而不被酒精脱色，则菌体呈兰紫色，为革兰氏阳性菌。如果细菌体内的结晶紫—碘复合物的颜色被酒精脱去，而复染上蕃红的颜色，则菌体呈红色，为革兰氏阴性菌。 此染色法之所以能将细菌区为G和G两类，是由于这两类菌的细胞壁成分不同所决定的。G菌的细胞壁较薄，含有的脂类物质较高，肽聚糖的含量较低，酒精处理时溶解了脂类物质，使细胞壁穿孔，通透性增大，在水洗时将细胞内原有的结晶紫—碘复合物冲走而脱色，再用蕃红复染就被染成了红色。G菌由于细胞壁厚，其中含有肽聚糖的量高，脂类含量低，用酒精处理时，使细胞壁脱水，肽聚糖层的孔眼缩小，通透性＋－＋－－＋第21页 共38页 降低，结晶紫—碘复合物被色在细胞内，而不会在水洗时被冲走，所以在复染时蕃红染液进不去，菌体最终仍呈兰紫色。 三、实验材料和器材： 1、菌种：白葡萄球菌斜面菌种、枯草杆菌斜面菌种、大肠杆菌斜面菌种均为培养18-24小时。 2、培养基及试剂：营养琼脂培养基、二甲苯、95％乙醇、苯酚、琼脂粉、香柏油、吕氏美兰染色液、革兰氏一液、革兰氏二液、革兰氏三液、革兰氏四液。 3、器材及耗材:双目显微镜、恒温培养箱、恒温干燥箱、洁净工作台、紫外线灯管、紫外线灭菌手推车、接种环、试管、酒精灯、滤纸、擦镜纸、载玻片、打火机、棉花、滴瓶、长塑料篓、纱布、吸耳球等 四、实验方法及步骤： 一）细菌的简单染色及显微镜油镜的使用、保养 1、涂片：于干净的载玻片中央滴一小滴无菌水，在无菌操作条件下，用接种环挑取少量细菌与无菌水充分混匀，涂成极薄的菌膜。（菌要挑少些，涂片要薄些，否则不易观察） 2、干燥：涂片后置室温自然干燥。 3、固定：手持载玻片的一端，有菌膜的一面朝上，通过酒精灯火焰上方3～4次。（用手背皮肤接触涂片反面，以不烫手为宜）以使细菌粘附在载玻片上更牢固。 4、染色：于菌膜上滴加吕氏美兰染液（以盖满菌膜为准），染色1～2分钟。 5、水洗：倾去染色液，用洗瓶中的蒸馏水自玻片的一端轻轻冲洗，直至流下的水无色为止（切勿使水直冲菌膜处。） 6、干燥：自然干燥或用滤纸轻轻盖在菌膜部位以吸去水份（切勿擦去菌体）。 7、镜检：先在低倍镜下找到菌斑。将显微镜筒向上移，再于菌斑处滴1滴香柏油，再将油镜头轻轻移下与载玻片接触。然后用目镜观察。此时镜筒仅仅稍微向上移动，看到菌斑后，在稍微调节细螺旋，即可看到细菌的形态。 8、油镜头的清洁：观察完毕后，取下油镜头，先用擦镜纸擦去香柏油，在用滴有二甲苯的擦镜纸擦净镜头，最后用干净的擦镜纸再擦净镜头。做好仪器使用登记即可。 二）细菌的革兰氏染色 1、制片：取二块干净的载玻片，各靠一小滴无菌水，以无菌操作规程分别挑取大肠杆菌和枯草杆菌少量，涂布于对应的载玻片上与无菌水混匀，涂成极薄的菌膜。自然干燥后再通过酒精灯进行热固定。 第22页 共38页 2、初染：于菌膜上滴加结晶紫染液，以盖满菌膜为宜，染色1-2 min后倾去染液，用蒸馏水轻轻冲洗至流下无色为止，甩去载玻片上的残余水。 3、媒染：滴加碘液染色1-2min，用蒸馏水冲洗干净。 4、脱色：滴加95%酒精液脱色30秒钟（准确计时），用蒸馏水冲洗干净。 5、复染：滴加蕃红液染色1-2min，用蒸馏水冲洗干净最后自然干燥。 6、镜检： 五、实验结果记录： 1、简单染色结果记录 绘出你所观察到的细菌形态图，并注明菌名、菌各部位名称及放大倍数。 2、革兰氏染色结果记录: 1、在显微镜油镜头下观察大肠杆菌被染成 色，枯草杆菌被染成 色。 2、结论：大肠杆菌属于革兰氏 菌，枯草杆菌属于革兰氏 菌。 六、实验结果分析及问题讨论： 实验十 利用毛霉有氧发酵生产豆制品 一、实验目的与要求： 1、学习利用毛霉发酵生产豆制品的原理和工艺过程。 2、观察豆制品发酵过程中的变化。 二、实验原理： 毛霉分布很广，常见的主要有高大毛霉、总状毛霉、鲁氏毛霉等。它们都能产生蛋白质水解酶、淀粉水解酶、脂肪水解酶。也就是分解大豆的能力很强。即在煮熟后冷却的黄豆上接种毛霉，经过前发酵培养和繁殖，分泌蛋白酶、淀粉酶、谷氨酰胺酶等复杂酶系，然后在长时间后发酵中与黄豆调料中的酶系、酵母、细菌等协同作用，使黄豆蛋白质缓慢水解，生成多种氨基酸，加之由微生物代谢产生的各种有机酸与醇类作用生成酯，形成细腻、鲜香的特色。 三、实验材料、仪器及试剂： 第23页 共38页 1、菌种：毛霉菌斜面菌种 2、培养基及试剂：马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）、二甲苯、95％乙醇、苯酚、琼脂粉、乳酸石碳酸美蓝染色液、黄豆、白酒、食盐、五香粉、姜、辣椒、保鲜膜、酵母膏等。 3、器材及耗材:双目显微镜、恒温培养箱、恒温干燥箱、洁净工作台、紫外线灯管、紫外线灭菌手推车、电子天平、电炉、漏勺、培养皿、不锈钢锅、放盘、500 mL三角瓶、接种环、试管、酒精灯、滤纸、擦镜纸、载玻片、打火机、棉花、滴瓶、长塑料篓、烧杯、剪刀、保鲜膜、玻棒、浆糊标签等 四、实验方法及步骤： 1、一星期前配制好马铃薯斜面培养基。 2、第一天 1）按无菌操作规程进行毛霉试管斜面接种，置于培养箱中25℃培养2～3天。 2）培养皿（3套/人）进行包扎及灭菌、250mL烧杯（3个/人）、方瓷盘（1个/2人）。 3）原料处理：将黄豆（1.2斤/大组）中的霉变的黄豆、泥土杂质等除去，后洗净，用清水浸泡一夜。将辣椒烘干磨成粉末状备用。 3、第二天 1）将黄豆加适量水，放在电炉上煮沸，保持沸腾30min。在接种室内将煮好的黄豆趁热分装于培养皿内，自然冷却，倒掉多余的水。 2）按无菌操作规程将毛霉菌接入培养皿中，充分混匀后，贴上标签，写上班级及学号，放入恒温恒湿培养箱中培养2～3天。 3）将菌种试管煮沸消毒后洗净上交。 4、第三天 1）肉眼观察：检验每个平皿中毛霉生长情况，如有杂菌的经老师认证后弃取不要。 2）镜检：于平皿中取少量菌制片染色后，于显微镜的高倍镜下观察是否有杂菌污染。认为不合格的经老师认证后决定弃取。 3）调味：将发酵好的黄豆转入方盘中，按比例放好各种调味品搅拌均匀，再转入250mL的烧杯中，于杯中加20～30mL白酒，用保鲜膜封口，贴好标签。 4）陈酿：将产品置于食品柜中低温陈酿半月后即可食用。 五、实验结果记录 第24页 共38页