食品微生物学实验指导(新国标)(7)

四、实验方法及步骤： 第一天 1、培养基的配制，调节酸碱度，装瓶，高压蒸汽灭菌。（一星期前准备）。 2、配制液体培养基，分装于装有产气发酵管的试管中，每支试管10mL，贴好标签，写上班级学号，包扎后进行灭菌。 3、所有玻璃器皿包扎好后进行灭菌。 第二天 第一法 大肠菌群MPN计数法 10、 大肠菌群MPN计数的检验程序见图1. 图1 大肠菌群MPN计数检验程序 1.1 样品的稀释 1.1.1 固体和半固体样品：25g样品，放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min～10000r/min均质1min～2min，或放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐第30页 共38页 水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min，制成1：10的样品匀液。 1.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品，置盛有225mLpH值应在6.5～7.5之间磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1：10的样品匀液。 1.1.3 样品匀液的pH值应在6.5～7.5之间，必要时分别用1mol/L氢氧化钠（NaOH）或1mol/L盐酸（HCl）调节。 1.1.4 用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1：10样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入9mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用一支1mL无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1：100的样品匀液。 1.1.5 根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成10倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。 1.2 初发酵试验 每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1mL，则用双料LST肉汤），36℃±1℃培养24h±2h，观察倒管内是否有气泡产生，如未产气则继续培养至48h±2h。记录在24h和48h产气的LST肉汤管数。未产气者为大肠菌群阴性，产气者则进行发酵试验。 1.3 复发酵试验 用接种环从所有48h±2h内发酵产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤管中，36℃±1℃培养48h±2h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。 1.4 大肠菌群最可能数（most probable number，MPN）的报告 根据大肠菌群阳性管数，检索MPN表（见附录B），报告每克（或毫升）样品中大肠菌群的MPN值。 第31页 共38页 附录B （规范性附录） 大肠菌群最可能数（MPN）检索表 大肠菌群最可能数（MPN）检索表每g（mL）检样中大肠菌群最可能数（MPN）的检索见表。 阳 性 管 数 95%可信限 阳 性 管 数 95%可信限 MPN MPN 0.10 0.01 0.001 下限 上限 0.10 0.01 0.001 下限 上限 0 0 0 <3.0 -- 9.5 2 2 0 21 4.5 42 0 0 1 3.0 0.15 9.6 2 2 1 28 8.7 94 0 1 0 3.0 0.15 11 2 2 2 35 8.7 94 0 1 1 6.1 1.2 18 2 3 0 29 8.7 94 0 2 0 6.2 1.2 18 2 3 1 36 8.7 94 0 3 0 9.4 3.6 38 3 0 0 23 4.6 94 1 0 0 3.6 0.17 18 3 0 1 38 8.7 110 1 0 1 7.2 1.3 18 3 0 2 17 17 180 1 0 2 11 3.6 38 3 1 0 43 9 180 1 1 0 7.4 1.3 20 3 1 1 75 17 200 1 1 1 11 3.6 28 3 1 2 120 37 420 1 2 0 11 3.6 42 3 1 3 160 40 420 1 2 1 15 4.5 42 3 2 0 93 18 420 1 3 0 16 4.5 42 3 2 1 150 37 420 2 0 0 9.2 1.4 38 3 2 2 210 40 430 2 0 1 14 3.6 42 3 2 3 290 90 1，000 2 0 2 20 4.5 42 3 3 0 240 42 1，000 2 1 0 15 3.7 42 3 3 1 460 90 2，000 2 1 1 20 4.5 42 3 3 2 1100 180 4，100 2 1 2 27 8.7 94 3 3 3 >1100 420 -- 1：本表采用3个稀释度[0.1g(mL)、0.01 g(mL)和0.001 g(mL)]，每个稀释度接种 3 管。 2：表内所列检样量如改用 lg（mL）、0.1g(mL)和0.01g(mL)时，表内数字应相应降低 10 倍；如改用0.01g(mL)、0.001g(mL)、0.0001g(mL)时，则表内数字应相应增高10倍，其余类推。 五、实验结果记录： 1、 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤培养产气结果记录 A：24小时产气管数： 稀释倍数 项目 1 10-1 2 3 1 10-2 2 3 1 10-3 2 3 产气管（+） 未产气管（-） 产气管数 B：48小时产气管数： 第32页 共38页 稀释倍数 项目 产气管（+） 1 10-1 2 3 1 10-2 2 3 1 10-3 2 3 未产气管（—） 各稀释度产气总管数 2、煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤管培养产气结果记录 稀释倍数 项目 产气管（+） 未产气管（—） 1 10-1 2 3 1 10-2 2 3 1 10-3 2 3 各稀释度产气总管数 3、根据大肠菌群阳性管数，检索MPN表（见附录B），报告每克（或毫升）样品中大肠菌群的MPN值。 4、革兰氏染色镜检结果记录： 5、本次实验结论： 第二法 大肠菌群平板计数法 大肠菌群平板计数的检验程序见图2. 图2 大肠菌群平板计数检验程序 2.1 样品的稀释 第33页 共38页 按1.1进行 2.2 平板计数 2.2.1 选取2个～3个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种两个无菌平皿，每皿1mL。同时分别取1mL生理盐水加入两个无菌平皿做空白对照。 2.2.2 及时将15mL～20mL冷至46℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3mL～4mLVRBA覆盖平板表层。翻转平板，置于36℃±1℃培18h～24h。 第三天 1.1 平板菌落数的选择 选取菌落数在15 CFU～150 CFU之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。典型菌落为紫色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大。 1.2 证实试验 从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB肉汤管内，36℃±1℃培24h～48h，观察产气情况，凡BGLB肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。 1.3 大肠菌群平板计数的报告 经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以2.3中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每克（或每毫升）样品中大肠菌群数。例：10-4样品稀释液1mL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品中的大肠菌群数为：100×6/10×104/g（mL）=6.0×105CFU/g（CFU/mL）。 2、观察液体发酵结果： 3、镜检：取紫红色的菌落制片，进行革兰氏染色，于油镜下观察，确定是否为无芽孢的革兰氏阴性杆菌。 五、实验结果记录： 1、观察大肠菌群平板计数结果记录于下表：（分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。典型菌落为紫色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大。） 平皿编号 菌落数 稀释10-1 -2 稀释10 稀释10-3 1 2 平均 2、煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤管培养产气结果经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以计数的平板菌落数，再乘以第34页 共38页