实验二 RNA的制备和分析
实验目的
通过本实验学习和掌握从植物组织中提取RNA的方法
实验原理
RNA是一类极易降解的分子，要得到完整的RNA，必须最大限度地抑制提取过程中内源性及外源性核糖核酸酶对RNA的降解。高浓度强变性剂异硫氰酸胍，可溶解蛋白质，破坏细胞结构，使核蛋白与核酸分离，失活RNA酶，所以RNA从细胞中释放出来时不被降解。细胞裂解后，除了RNA，还有DNA、蛋白质和细胞碎片，通过酚、氯仿等有机溶剂处理得到纯化、均一的总RNA。
材料
玉米、水稻、小麦等农作物根或叶
仪器试剂
(一) 仪器 1． 低温离心机 2． 分光光度计
3． 琼脂糖胶电泳系统，用前先用1% Na OH溶液浸泡过夜，之后再用DEPC水浸泡冲洗。 4． 高压灭菌锅
5． 研钵、剪刀、一次性手套等 (二) 药品
1. 焦碳酸二乙酯(DEPC) 2. 吗啉代丙烷磺酸(MOPS) 3. 异硫氰酸胍 4. 醋酸钠(NaAc) 5. 氯仿 6. 苯酚 7. 甲醛 8. 乙醇
9. 乙二胺四乙酸(EDTA) 10. 琼脂糖
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11. 异丙醇 (三) 试剂配方 1． 0.1% DEPC水
0.1 ml DEPC 加入100 ml三蒸水中，振摇过夜，再湿热灭菌。
2. 2 mol/L NaAc、0.5 mol/L EDTA、4 mol/L异硫氰酸胍、4 mol/L LiCl等均用DEPC水 配制。
3. 5ΧMOPS 电泳缓冲液(pH 7.0) MOPS 0.1 mol/L NaAc 40 mmol/L EDTA 5 mmol/L
(溶液均需用DEPC处理过的水配制)
操作步骤
方法1
1. 取幼叶约250 mg在液氮中研磨至细粉，转入预冷的1.5 ml离心管； 2. 加入1 ml TRIZOL提取液震荡摇匀；
3. 室温放置5 min后，加入0.5 ml的氯仿，剧烈摇动离心管5 min； 4. 在8℃条件下，12000 rpm离心15 min；
5. 溶液分为两层，下层为酚－氯仿浅红色液层，将上层液体移入干净离心管， 加入0.5 ml异丙醇在15~30℃条件下，沉淀10 min；
6. 然后在, 2~8℃条件下，12000 rpm离心10 min，RNA沉淀管壁和底部； 7. 去掉液体部分，加入1 ml 75%酒精洗2次；
8. 风干后，加入25 μl DEPC处理过的水溶解RNA，储藏于-80℃冰箱备用。 方法2 1. 匀浆处理:
a.组织 将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。
b.单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml，用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有how(event)\污染。
c．细胞悬液 离心收集细胞，每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml
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TRIzol，反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。
2．将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。
3．可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃10000×g离心10分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。
6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。
7. 把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。 8. 2-8℃10000×g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。
9. 用75℅乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75℅乙醇。2-8℃不超过7500×g离心5分钟，弃上清。
10.室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大约晾5-10分钟即可.不要真空离心干燥，过于干燥会导致RNA的溶解性大大降低。加入25-200μl无RNase的水或0.5℅SDS,用枪头吸打几次,55-60℃放置10分钟使RNA溶解.如RNA用于酶切反应,勿使用SDS溶液。RNA也可用100℅的去离子甲酰胺溶解，-70℃保存。
注意事项
1. 从少量样品（1-10mg组织或102-104细胞）中提取RNA时可加入少许糖原以促进RNA沉淀。例如加800ml TRIzol匀浆样品，沉淀RNA前加5-10μg RNase-free糖原。糖原会与RNA一同沉淀出来，糖原浓度不高于4mg/ml是不影响第一链的合成，也不影响PCR反应。 2. 匀浆后加氯仿之前样品可以在-60至-70℃保存至少一个月。RNA沉淀可以保存于75% 酒精中2-8℃一星期以上或-5至-20℃一年以上。
3. 分层和RNA沉淀时也可使用台式离心机，2600×g离心30-60分钟。 预期产量：1mg组织或1×106细胞提取RNA分别为：
肝和脾6-10μg ,肾3-4μg ,骨骼肌和脑组织1-1.5μg ,胎盘1-4μg ,上皮细胞8-15μg ,成纤维细胞5-7μg 。
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常见问题分析：
得率低：A.样品裂解或匀浆处理不彻底 B. RNA沉淀未完全溶解
A260/A280<1.65 ：A.检测吸光度时，RNA样品没有溶于水，而溶于了TE中。低离子浓度和低pH值条件下A280值偏高 B．样品匀浆时加的试剂量太少 C. 匀浆样品时未在室温放置5分钟 D. 吸取水相时混入了有机相 E .RNA沉淀未完全溶解。
RNA降解：A.组织取出后没有马上处理或冷冻
B. 待提取RNA的样品没有保存于-60至-70℃,而保存在了-5至-20℃ C. 细胞在用胰酶处理时过度
D. 溶液或离心管未经RNase去除处理 E. 电泳时使用的甲醛pH值低于了3.5 DNA污染: A. 样品匀浆时加的试剂量太少
B. 样品中含有有机溶剂(如乙醇,DMSO等),强缓冲液或碱性溶液
蛋白聚糖和多糖污染: 沉淀RNA的过程中作以下改进可去除这些污染，步骤7中,每使用1ml TRIzol在水相中加0.25ml异丙醇和0.25ml高盐溶液(0.8M柠檬酸钠和1.2M NaCl)混合离心,按之前操作进行。这种方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中，高效沉淀出纯RNA。从含有大量多糖的植物中提取RNA时应在匀浆后离心，并加上以上操作步骤。 4. 在研磨过程中，利用液氮时刻使组织保持冰冻状态。
5. RNA酶是一类生物活性非常稳定的酶类，除了细胞内源RNA酶外，外界环境中均存在RNA酶，所以操作时应戴手套，并注意时刻换新手套。
思考题
1. 实验中使用的各种药品的作用？
2. 真核生物的总RNA提纯后，可以继续做那些工作？
3. DNA和RNA相比，为什么说提纯植物细胞的mRNA是研究结构基因更关键的一步
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实验三 蛋白质的提取及检测
实验目的
熟悉植物叶蛋白的几种提取原理和方法，了解其意义及其应用价值。
实验原理
以蛋白质和结构与功能为基础，从分子水平上认识生命现象，已经成为现代生物学发展的主要方向，研究蛋白质，首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识，但基本原理不外乎两方面。一是得用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析，有机溶剂提取，层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于来同区域而达到分离目的，如电泳，超速离心，超滤等。在所有这些方法的应用中必须注意保存生物大分子的完整性，防止酸、硷、高温，剧烈机械作用而导致所提物质生物活性的丧失。蛋白质的制备一般分为以下四个阶段：选择材料和预处理，细胞的破碎及细胞器的分离，提取和纯化，浓细、干燥和保存。
植物叶蛋白或称绿色蛋白浓缩物(leafproteinconcentration，简称LPC)，是从新鲜植物叶片中提取的高质量浓缩蛋白质，不仅是畜禽生长发育和生产畜产品的主要营养物质，而且目前也正成为人类的保健营养理想食品之一。天然蛋白存在于为数甚多的植物体内，对其分离应依据人们的利用目的及提取蛋白含量和品质加以考虑。
天然蛋白质一般在溶液中呈稳定的亲水胶体状态，故LPC亦称叶蛋白胶。其特点是： (1)水化作用即蛋白质分子表面附有能有效防止蛋白质分子沉淀析出的水化膜； (2)电荷排斥作用水化膜外还有电荷层(具阴、阳离子)能有效地防止蛋白质分子的凝集。故溶液蛋白质颗粒(溶质)呈溶解状态；(3)欲提取植物组织中的蛋白质必须利用溶解度的差异进行分离纯化(如盐析、有机溶剂分级沉淀法、疏水层析、结晶、加热、离心分离等法)，利用分子大小和形状差异进行分离纯化(分子筛层析法)；还可利用电荷性质的差异分离纯化(离子交换法)。只要创造上述影响因素，即可使蛋白质从植物叶片中分离并沉淀出来。
植物叶蛋白提取一般遵循如下基本原则：尽可能提高样品蛋白的溶解度，抽提最大量的总蛋白，减少蛋白质的损失；减少对蛋白质的人为修饰；破坏蛋白与其他生物大分子的相互作用，并使蛋白质处于完全变性状态。根据该原则，植物叶蛋白制备过程中一般需要有四种试剂①离液剂：尿素和硫脲等；②表面活性剂：又称去垢剂，早期常用NP-40、Tritonx-100等非离子型去垢剂，离子型去垢剂有SDS、胆酸钠、LiDS等，还有象CHAPS(含
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