Detection Buffer：0.1M Tris-HCl、0.1M NaCl及50mmol/L MgCl2调pH至9.5。 3仪器：恒温水浴震荡器（室温-100℃），杂交袋，水浴锅，暗盒。
实验步骤
1.DIG标记探针的制备
1) 取纯化好的待标DNA 1μg，体积为16μl，于100℃水浴中变性10min，取出后立即置于冰上5 min。
2) 在冰上加入4μl随机引物标记试剂,其中含有核苷酸混合物、随机引物、Klenow enzyme和反应缓冲液。混匀后置37℃保温至少1hr，可长至20h以提高标记量。 3) 加2ul 0.2M EDTA或65℃加热10min中止反应,置－20℃放置备用。 2.预杂交
将处理好的NC膜用2×SSC浸润5min后放到杂交袋中，加入预杂交液（用Maleic acid Buffer稀释10×封闭液为1×封闭液）50－100mL， 65℃预杂交30min-6hr。 3.杂交
将预杂交过的膜放入杂交袋中，加入5mL的杂交液（用灭菌ddH2O溶解浓缩的固体杂交液成分）。将标记好的探针沸水浴变性5－10min，冰上5min，加到杂交袋中，混匀，赶出气泡。42℃摇动杂交过夜。 4.洗膜
经过杂交的膜用洗膜液I（2×SSC, 0.1%SDS）室温下振动洗膜5min，重复一次。然后用洗膜液II（0.5×SSC, 0.1%SDS）60-68℃洗两次，每次15min。 5.免疫反应
1) 用50mLWashing buffer短暂浸膜1-5min。 2) 将膜置1×blocking solution 100mL中封闭30min。
3) 用1×blocking solution按1：10000稀释DIG抗体-AP至75mU/mL，将膜浸在10－20mL抗体溶液中30min。
4) 用100mL Washing buffer洗膜两次，每次15min。 5) 用20mL Detection Buffer平衡2～5min。 6．杂交信号检测
1）将杂交膜放入小塑料袋中，有DNA一面朝上，在上面加1mL反应底物CSPD。赶走气泡，使反应液均匀分布，封口后15-25℃平放5 min。倒掉反应液，封口，37℃放置10 min增强光子释放。
21
2）用保鲜膜包好，暗室中压X光片。曝光4-48hr。
注：光子的释放在最初的几个小时达到高峰，并能维持24-48 hr。
注意事项
DNA杂交信号没有或很弱可能有以下原因引起: 试剂过期;没用带正电荷的尼龙膜而用其他类型的膜；探针浓度低或标记效率差;抗体浓度低; 过度洗膜;曝光时间短。
杂交背景高可能由于预杂交时间短、洗膜不彻底、探针浓高、抗体浓度高和选用错误类型膜等原因引起。
思考题
1. 核酸杂交的各步试剂的作用是什么?其特异性取决于什么? 2. 放射性核素杂交和非放射性杂交的优缺点?
22
实验七 λDNAHindⅢ酶切鉴定
实验目的
通过本实验了解限制性内切酶的特性，学习和掌握根据具体目的设计适当的酶切体系。
实验原理
利用限制性内切酶切割DNA是DNA重组过程中的关键步骤之一。成功的酶切为后续工作提供了有效的实验材料。限制性核酸内切酶是一类能识别并水解双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶。它的识别位点具有180°旋转对称的回文结构，一般能识别4-6个碱基对，并在特定位点切割，例如HindIII的识别序列：
。
限制性内切酶的活性以酶的活性单位表示，1个酶单位（1Unit）指的是在指定缓冲液中，37℃下反应60min,完全酶切1μg的纯DNA所用的酶量。
本实验使用HindⅢ 酶对λDNA分子进行酶解，并通过琼脂糖凝胶电泳分离鉴定。λDNA是噬菌体的基因组DNA, 是线状，双链的DNA, 大小约为48.5kb, 它的上面有7个HindⅢ 限制性内切酶的酶切位点，经过HindⅢ酶切之后就产生8个大小为23Kb，9.4Kb， 6.5Kb， 4.3Kb， 2.3Kb， 2.0Kb，564bp，125bp的片断，通过琼脂糖凝胶电泳,在紫外灯下可见到8条电泳条带。
实验步骤
In a 1.5 ml centrifuge tube, add ddH2O 12.5 μl, 10 × buffer 2.0 μl, 1 mg/ml acetylated BSA 2.0 μl, 0.35 μg/μl λDNA 3.0 μl, 16 U/μl HindⅢ restriction enzyme 0.5 μl. Incubate at 37℃ for at least 1 h.（加入试剂体积（μl）灭菌水 13，MULT buffer 2，λDNA 4，HindⅢ１，
总体积 2０ ）
NOTE: Wear rubber or plastic gloves during the following steps.
1 In 250 ml flask, add 2.4 g agarose and 300 ml 0.5 × TBE (table 1). Melt agarose in microwave oven, mixing several times during heating. Add 2 μl GoldViewTM DNA dye. Cool to about 60℃ keeping covered to avoid evaporation.
2 Tape ends of gel tray, insert comb, pour agarose in and allow to be solidified.
3 Remove tape, place gel tray in electrophoresis tank, fill tank to about 1 mm higher than gel
23
top face with 0.5 × TBE and remove comb.
4 Heat λDNA (30 ng/μl) and bromophenol blue loading buffer (table 2) mixture at 65℃ for 10 min and place immediately on ice for 5 min. Load in well as molecular weight marker. 5 Load samples.
6 Run electrophoresis at 125 volt (5 volt/cm) until bromophenol blue has migrated to just above the next set of wells.
7 Remove tray from tank and take picture with ultraviolet light in gel image system.
注意事项
1 酶切反应体系依不同的酶、不同的酶切目的而异。
2 37℃保温一段时间后可取少量样品电泳检测。若已达到酶切目的可结束反应。 3 使用加热使酶失活应视限制性内切酶的特性而异；也可使用EDTA使酶失活。
24
实验八 DNA片段的纯化回收
实验目的
了解DNA片段的纯化回收基本原理，掌握基本技能
实验原理
载体及目的DNA 片断经酶切后，如果无多余的片断（如载体单切）可以直接酚/氯仿抽提后乙醇沉淀回收直接连接用。但多数还有多余片断（如载体双酶切后有插入片断但要回收空载体，多个目的DNA片断选择其一克隆），必须电泳分离后回收目的片断。回收的方法既有传统的方法，这些方法基于降低凝胶的熔点以释放DNA，然后通过酚/氯仿抽提后乙醇沉淀回收，也有公司生产的商品化的试剂盒可用，这些试剂盒多采用凝胶裂解液（如含有降低熔点的NaI）融化凝胶释放DNA后，采用特殊的硅胶树脂吸附DNA后，用洗液洗去杂质，最后用洗脱液洗出DNA。
材料、试剂和仪器
材料
待回收DNA样品 试剂
1) 1% 低熔点胶，琼脂糖，
2) glassmilk kit: 裂解缓冲液，漂洗液，glassmilk 3) TE, ddH2O,
4) 酚/ 氯仿, 氯仿, 无水乙醇，70％乙醇，
5) DNA回收试剂盒: 树脂， 80％异丙醇，Syringe Barrel, 3仪器： 离心机 ， 水浴锅， 电泳仪
实验步骤
1 低熔点胶法：
1) 电泳到适当位置后在目的DNA条带的前端挖一长方形槽，向槽中加入融化的低熔 点胶，待凝固后进行电泳。当DNA进入低熔点胶中心时停止电泳。紫外灯下切下目的条带的低熔点胶。
2) 将切下的胶放到离心管中，加入200ul的TE，65℃温浴3min以融化低熔点胶。 3) 分别用酚/氯仿，氯仿抽提一次。
4) 取上清，加入2倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀DNA 2hr以上，12 000rpm离心15min，弃上
25