氨苄青霉素（Amp） 母液:50mg/ml(溶水) 工作浓度:50ug/ml 氯酶素（Cml） 母液:34mg/ml(溶乙醇) 工作浓度:170ug/ml 卡那霉素（Kan） 母液:10mg/ml(溶水) 工作浓度:50ug/ml 链霉素（Sm） 母液:10mg/ml(溶水) 工作浓度:50ug/ml 四环素（Tet） 母液:5mg/ml(溶乙醇) 工作浓度:50ug/ml 这是一种青霉素的衍生氨苄青霉素抗性基因（bia物，它通过干扰细菌胞壁或ampr），编码的一种周合成之末端反应，而杀死质酶，即β－内酰胺酶，可生长的细胞 特异地切割氨苄青霉素的β－内酰胺环，从而使之失去杀菌的效力 这是一种抑菌剂，它通过氯酶素抗性基因（cai或同核糖体５０Ｓ亚基的结cmlr）编码的乙酰转移酶，合作用，干扰细胞蛋白质它特异地使氯霉素乙酰化的合成，并阻止肽键的形而失活 成 这是一种杀菌剂，它通过卡那霉素的抗性基因（kan同７０Ｓ核糖体的结合作或kanr）编码的氨基糖苷用，导致mRNA发生错读磷酸转移霉，可对卡那霉(misreading) 素进行修饰，从而阻止其同核糖体之间发生相互作用 这是一种杀菌剂，它通过链霉素抗性基因（str或同核糖体的３０Ｓ亚基的strr）编码的一种特异性结合作用，导致mRNA发霉，可对链霉素进行修饰，生错译 从而抑制其同核糖体３０Ｓ亚基的结合 这是一种抑菌剂，它通过四环素抗性基因（tet或同核糖体３０Ｓ亚基之间tetr）编码的一种特异性的的结合作用，阻止细菌蛋蛋白质，可对细菌的膜结白质的合成 构进行修饰，从而阻止四环素通过细胞膜从培养基 31
中转运到细胞内
3仪器: 恒温摇床， 冰冻离心机，恒温培养箱， CaCl2转化法
(1) 划线复壮宿主菌37℃过夜。挑一单菌落于30mL LB液体培养基中，37℃，200rpm摇至OD600=0.2-0.4，取出置于冰上10-15min。
(2) 取1mL菌液于灭菌的1.5mL离心管中。4℃,5000rpm离心5min回收细胞。弃上清， 吸干残存培养基，加500μl冰预冷的0.1M CaCl2,重悬菌体，置冰浴15-30min。
4℃,5000rpm离心5min回收细胞。弃上清，吸干水，加100μl冰预冷的0.1M CaCl2重悬菌体。放置于4℃用于转化，若不用则加30%甘油置-70℃备存。
(3) 加入10μl连接产物到100ul感受态细胞中，轻旋以混和内含物，置于冰上30min。 (4) 42℃热休克90sec，不要摇动试管。置冰上1-2min。 (5) 加400ul 液体培养基，37℃150rpm摇培45-60min。
(6) 微波炉融化LB固体培养基，待冷却至50℃左右时，根据载体的抗性加入相应的抗生素，如Km 母液至终浓度50ug/mL或Amp母液至终浓度60ug/mL ，摇匀。趁热倒平板，每板20mL左右，室温下凝固10-15min。
(7) 取适量菌液（体积别超过200 ul，如果想多涂菌可以先室温下5000rpm离心5min回收细胞，弃去一部分培养基后，重悬细菌后再涂），加入5ul IPTG（0.5M） 和30ul X-gal (100mg/mL) ，混匀，加到抗性平板上，用烧过灭菌的涂布器涂布器涂匀，涂布器应凉下来用，否则容易烫死细菌。
(8) 培养皿用石蜡膜封好后，37℃倒置培养过夜。待出现蓝色时取出放在4℃冰箱中，使其颜色更加明显。
注意: 1 ）质粒DNA要纯 2 ）受体细菌的OD600nm=0.3-0.4 3） 重组质粒的体积小于转化菌液体积的1/10。
结果与分析
若抗性平板上出现白色菌落，说明连接的重组质粒被转化。根据蓝白的比例可以判断重组率，根据菌落数目可以计算出转化率。一般来说采用定向连接的重组质粒的重组率较高，而平末端或单一酶切位点连接的重组率较低。
32
转化是一定设不加质粒只含感受态宿主菌的负对照和加入已知抗性的质粒的正对照，以便分析结果。如果负对照长出菌落说明感受态宿主菌具有抗性或抗生素失活，而正对照没出来，说明感受态细胞有问题或加错抗生素或操作过程中造成细菌死亡（如涂布时烫死）。
图6 蓝白筛选
思考题
1 转化的原理是什么?转化注意事项? 2 蓝白筛选的意义和原理?
33
第二章 植物基因转化技术
实验一 农杆菌浸染的油菜花瓣转化表达GUS基因试验
实验目的
转基因植物在近代工业、医药业、特别是农业等各个领域的研究和应用越来越为人类所重视。通过农杆菌对植物植株、器官、组织及细胞的侵染进行质粒转化，是将外源基因导入目的植物的重要方法之一。本实验使同学了解农杆菌对植物质粒转化的基本原理及具体操作过程，从而对转基因植物的产生和外源基因转入植物后产生的特殊性状具有更加感性的认识。
实验原理
将外源基因人为导入天然植物中，从遗传物质水平上对植物进行有目的改造，由此获得转基因植物，其性状将按着有利于人们需要的方向发生改变。如转基因的抗虫棉花，通过人们的改造，使棉花在生长过程中体内能够自主地产生抵抗害虫的毒素，以达到自我保护、减少农药使用增产增收的目的。
随着科学家的不断探索，将人们获得的有用基因转入目的植物方法发展较快，现有农杆菌介导法、基因枪轰击法、细胞显微注射法、花粉管真空渗透法、化学法及电穿孔法等，其中农杆菌介导法是今仍然广泛使用的一种有效转化方法。农杆菌介导法所使用的质粒载体分根癌农杆菌和发根农杆菌两大类。在植物基因工程中以根瘤农杆菌的Ti质粒介导的遗传转化最多。根瘤农杆菌侵染植物是一个非常复杂的过程。根瘤农杆菌具有趋化性，即植物的受伤组织会产生一些糖类和酚类物质吸引根瘤农杆菌向受伤组织集中。酚类物质和糖类物质既可以作为根瘤农杆菌的趋化物，又可以作为农杆菌中Ti质粒上Vir区（毒性区）基因的诱导物，使Vir区基因活化，导致T-DNA的加工和转移，从而侵染植物细胞。 Ri质粒具有普通的质粒的特点：是细菌染色体外的遗传物质，能独立复制，为闭合环状双链DNA。它是非必要的遗传物质，一般控制细菌的次要性状，可自我复制并具有遗传的稳定性，在特殊环境中对细菌的生存起着重要的作用。它具有可转移性、可重组性、可整合性、可消除性等特点。Ri质粒的环状基因可按功能可分为Vir、T-DNA、Ori三个区，该三个功能区在对植物的浸染与表达中分工明确。
Vir区的作用：该区基因不发生转移，但它在T-DNA转移的过程中起着十分重要的作用，这个区的缺矢或突变会使发根农杆菌的菌株丧失对植物的侵染能力。Vir区7个基因群（A-G）的A一直处于活性表达状态而其它的6个基因通常情况下处于抑制状态。发根农
34
杆菌感染寄主时，被损伤的植物细胞会合成特殊的小分子酚类化合物乙酰丁香酮等，此时其可以与Vir区A基因的表达产物结合，诱导其它的联合基因的活化，从而发生感染过程。 T-DNA区的特点与功能：T-DNA区的基因群具有致使发状根产生（包括生长素合成）的有关基因、冠瘿碱合成的有关基因以及某些抗性标记基因和特殊的酶切位点。其在侵染的过程中转移到寄主的细胞中与其DNA相整合，从而随寄主细胞中的DNA进行复制和表达。由于真核细胞中才具有T-DNA区的基因群中某些基因（如生长素合成的有关基因、冠瘿碱合成的有关基因等）的功能启动子，因而这些基因只能在寄主真核细胞中转录表达，在农杆菌中处于抑制状态。
Ori区的功能：在农杆菌中启动质粒DNA的复制。
农杆菌将T-DNA转入寄主的过程：首先受伤的植物从伤口处产生特殊的小分子酚类化合物乙酰丁香酮等，与Vir区A基因的表达产物结合，诱导其它的联合基因的活化，从而发生感染过程，T-DNA区的两端先后单链短裂，短裂下来的单链T-DNA被转移到植物细胞中与植物的基因组随机的整合，Ri质粒中移走的T-DNA区通过DNA复制得到修复，因此尽管发生了单链T-DNA的转移，发根农杆菌细胞没有因此丧失任何遗传信息。
β-葡糖苷酸酶基因，简称Gus基因，是从大肠杆菌中分离克隆到的一个基因。当它的产物β-葡聚苷酸酶与特定的生色底物X-Gluc试剂结合，能产生特定的蓝颜色反应 (β-葡聚糖苷酶（GUS）可将X-Gluc水解成蓝色物质，因此具有GUS活性的部位或位点呈现蓝色或蓝色斑点，可用肉眼或显微镜观察到) ，因此，常作为植物转基因研究中的报道基因。用X-Gluc试剂溶液处理该基因转化后的植物组织，通过组织化学的染色反应，来“报道”植物是否被转化，基因是否被导入。油菜基因组中不存在Gus基因，因此，油菜的组织与X-Gluc试剂溶液不可能产生蓝颜色反应。
通过农杆菌介导的转基因方法，把Gus基因导入至油菜的花瓣，用X-Gluc试剂溶液处理，花瓣呈蓝色反应，证明Gus基因已经整合至这一植株的染色体中。(由于Gus基因的插入是随机的，而且，不可能同时插入在一对同源染色体的同一位点上，因此，染色体上的外源Gus基因在减数分裂过程中，会随同源染色体发生分离重组。这样转基因植株上收获的种子，用X-Gluc试剂溶液处理，籽粒中出现颜色分离。这种颜色反应和籽粒颜色分离可以通过实验直接被观察到。而且，可通过卡方测验，来检测籽粒颜色分离是否符合孟德尔的分离规律。)
试剂及配方
浸染液：A: 50mmol/L 磷酸钠缓冲液（ph7.0）A:NaH2PO4.2H2O 3.12g 定容100ml B:
35