实验五 PCR基因扩增及其影响因素分析
实验目的
了解聚合酶链式反应的原理。
掌握移液枪和PCR仪的基本操作技术。
实验原理
PCR技术，即聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是由美国PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年（1993年获诺贝尔化学奖）建立的。这项技术可在试管内的经数小时反应就将特定的DNA片段扩增数百万倍，这种迅速获取大量单一核酸片段的技术在分子生物学研究中具有举足轻重的意义，极大地推动了生命科学的研究进展。它不仅是DNA分析最常用的技术，而且在DNA重组与表达、基因结构分析和功能检测中具有重要的应用价值。
PCR可以被认为是与发生在细胞内的DNA复制过程相似的技术，其结果都是以原来的DNA为模板产生新的互补DNA片段。细胞中DNA的复制是一个非常复杂的过程。参与复制的有多种因素。PCR是在试管中进行的DNA复制反应，基本原理与细胞内DNA复制相似，但反应体系相对较简单。
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；
②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；
③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。
重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
材料
Amplify core sequence of Bt gene from genomic DNA of transgenic maize plant and plasmid (CK) with the method of polymerase chain reaction.
实验步骤
22.
On ice, in 0.2 ml centrifuge tube, add:
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Stock ddH2O 10 × buffer 25 mmol/L MgCl2 2.5 mmol/L (each) dNTP 1 μmol/L (each) primers
Template DNA
10 ng/μl pCUSBK-Hyg ? ng/μl Genomic DNA 5 U/μl Taq
23.
For 20 μl Final concentration
Up to 20 μl 2.0 μl 2.0 μl 1.2 μl 5.0 μl 2.0 μl ? μl 0.2 μl
1 × 2.5 mmol/L 150 μmol/L 0.25 μmol/L 5 ng 50 ng 1 U
Amplify from maize genomic DNA with following program: 1 cycle of
30 cycles of 94℃ for 30 sec 55℃ for 30 sec 72℃ for 30 sec
1 cycle of 72℃ for 5 min
Keeping at
4℃
94℃ for 5 min
24.
Amplify from plasmid with following program: 1 cycle of
30 cycles of 94℃ for 10 sec 55℃ for 10 sec 72℃ for 30 sec
1 cycle of 72℃ for 5 min
Keeping at
4℃
94℃ for 1 min
NOTE: Wear rubber or plastic gloves during the following steps. 25.
In 500 ml flask, add 2.0 g agarose and 200 ml 0.5 × TBE. Melt agarose in microwave oven,
mixing several times during heating. Cool to about 60℃ keeping covered to avoid evaporation. 26. 27.
Tape ends of gel tray, insert comb, pour agarose in and allow to be solidified.
Remove tape, place gel tray in electrophoresis tank, fill tank to about 1 mm higher than gel
top face with 0.5 × TBE and remove comb. 28. one. 29.
Run electrophoresis at 85 volt (5 volt/cm) until bromophenol blue has migrated to just Load Φ174 Hinc II in first well as molecular weight marker and amplified samples one by
above the next set of wells. 30.
Remove tray from tank, stain in 0.5 μg/ml EB for 10 min with gentle shaking.
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31. 32. 33.
Destain in 10 mmol/L MgCl2 for 5 min with gentle shaking. Rinse in H2O for 10 min with gentle shaking. Take picture with ultraviolet light in gel image system.
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实验六 核酸印迹技术-DIG标记探针的分子杂交
实验目的
掌握实验的核酸印迹技术基本原理，熟悉基本操作
实验原理
放射性核素因其灵敏度高而被人们利用在杂交筛选中，但它标记探针可利用时间短（放射性同位素有半衰期，如32P为14.2天），并且对人体有害，易污染环境，所以近年来逐步发展了非放射性杂交筛选。按照标记方法的不同,主要有两类, 一种是预先已连在NTP 或dNTP上, 因此可象放射性核素标记的核苷酸一样用酶促聚合反应方法参入到核酸探针上, 如生物素, 地高辛等, 由于生物素等标记物是连接在碱基上, 而不是磷酸基团, 因此不能用多核苷酸激酶进行末端标记。 另一类是直接与核酸进行化学反应而连接在核酸上, 如生物素化学标记法的主要思路是: 将生物素与另一种化学性质较活泼的基团相连, 在特定的条件下是活泼基团活化而与核苷酸特定部位共价结合。DIG（地高辛）、HRP（辣根过氧化物酶）及生物素等, 它们常通过显色，发光来显示杂交信号。本实验中就是通过连接臂共价连接在dUTP C11上，如图13所示。DIG标记的dUTP代替部分dTTP掺入待标探针中，经杂交后用与碱性磷酸酶Ap（alkaline phosphatase）连接的DIG抗体发生免疫反应，通过Ap使反应底物CSPD脱磷，脱磷后的产物不稳定，继续分解同
图13 DIG标记的dUTP化学分子结构
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图14 Ap分解底物释放光子的反应过程
图15 DIG标记探针的Southern blotting过程示意图
材料，试剂和仪器
1 材料：模板 DNA转移的膜，待标DNA探针 2 试剂
1) DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II 试剂盒提供的试剂
浓缩的固体杂交液成分（DIG Easy Hyb granules），随机引物标记试剂(DIG-High Prime)，10×封闭液(Blocking solution)，DIG抗体-AP(Anti-Digoxigenin AP Conjugate)，反应底物CSPD(CSPD ready-to-use)
2）洗膜液： （1）2×SSC及0.1%SDS（2）0.5%SSC及0.1%SDS。 3）杂交及免疫反应所需附加的试剂
Maleic acid Buffer: 0.1M Maleic acid（顺丁烯二酸）及0.15M NaCl用固体NaOH pH至7.5。 Washing buffer: 0.1M Maleic acid（顺丁烯二酸）及0.15M NaCl,0.3%(v/v)tween20,用固体NaOH pH至7.5。
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