Na2HPO4.12H2O 7.17g定容100ml A取39ml B取61ml 混合定容100ml
农杆菌OD值1.8-2.0（500ml的液体培养出来的农杆菌可以和1L的缓冲液混合1:2）
实验步骤
1) 取浸染液浸染油菜花序，把那些太小的和已经开花的去掉，也要去掉腋芽，要浸泡的是含苞欲放的花蕾、花蕾下面的嫩叶及腋芽，浸泡5分钟。此后间隔1、3、5天重复浸泡。 2) 浸染后挂牌在上面写上自己的名字。
3) 瞬时表达检测取浸渍后7-10天的材料：浸泡几天后就开花了检测花瓣或新长出的腋芽或柱头或花蕾下面的嫩叶。
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实验二 基因枪介导的基因转化实验
实验目的
掌握基因枪介导转化的原理和方法
实验原理
基因枪法，又称生物弹法或微粒枪法、微粒轰击法，是依赖高速度的金属颗粒将外源基因引入活体细胞的一种转化技术。它是继农杆菌介导转化法之后又一应用广泛的遗传转化技术。这种方法操作简单，效率高，适应性强。一次可以向数以千计的细胞导人基因，不受细胞、组织或器官的类型限制，此外其目标命中率高，因此格外受重视。基因枪根据其加速装置可分为火药式、电动式和气动式。
经适当处理后，使DNA液均匀地吸附在或包裹于微小的钨粉或金粉颗粒表面，利用基因枪的火药爆炸、高压放电或高压气体作驱动力，发射出微弹与DNA的复合体，击中并高速穿透真空室中受体细胞的细胞壁及细胞膜，进入细胞内，从而达到将吸附于微弹上的外源DNA导人细胞或原生质体，获得整合与表达的目的。微弹复合体对受体细孢造成的损伤可以修复。
实验步骤
1 取金粉悬液（60mg直径1.5一3.0 p m的金粉用无水乙醇消毒，悬浮于Iml 无菌水中）25p 1， 加人5,ug 质粒DNA,50 y1 2 .5mol/L,2Cal 20川0.1m ol/L亚精胺，充分混匀，离心，无水乙醇沉淀，重新悬于60风无水乙醇，备用。
2 可裂膜选用1550psi，将可裂膜、载体膜事先用70％乙醇浸泡半小时，在超净工作台晾干。 3 每次吸取10风DNA－金粉复合体涂布于载体膜，充分晾干
4 选取生长状态旺盛、大小一致的愈伤组织进行轰击，靶材料距离可裂膜6cm，每皿受体
材料轰击1次。
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实验三 转化目的基因的检测- GUS组织化学染色
实验目的
掌握GUS组织化学染色方法
实验原理
适宜的反应条件下，β-葡聚糖苷酶（GUS）可将X-Gluc水解成蓝色物质，因此具有GUS活性的部位或位点呈现蓝色或蓝色斑点，可用肉眼或显微镜观察到。
实验材料
转基因油菜花瓣
药品试剂
1) X-Gluc，用N-N-二甲基酰胺配成20mM的贮存液，分装成每管100μL，保存于-20℃。 2) 底物溶液（染色液）：
1mM X-Gluc加入100mM磷酸钠缓冲液（pH=7.0）,缓冲液中含10mM EDTA-Na2，1-5mM K3[Fe(CN)6](铁氰化钾)，1-5mM K4[Fe(CN)6](亚铁氰化钾)，0.001%（V/V）Triton X-100 染色液：50mmol/L 磷酸钠缓冲液（ph7.0）中含：0.1mol/L K3[Fe(CN)6] +0.1mol/L K4[Fe(CN)6] +10mol/L Na2EDTA+ 0.001%(v/v) Tritonx-100+0.1-0.3% x-gluc(注：母液两周内使用有效，最好现用现配) 实验器材
小药瓶，培养皿，培养箱（37℃），微量移液器
实验步骤
1 将材料放在5ml的离心管里面，管中预先加入2ml的染色液，回到实验室用抽气机抽气10-20min。
2 放入30度恒温箱过夜培养。
3 70%酒精脱色2-24小时（除去叶绿素），中途换酒精。 4 第二天镜检,白色背景上的蓝色斑点既是GUS表达位点。
实验结果
花瓣上GUS活性的部位或位点呈现蓝色或蓝色斑点。
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第三章 植物育种分子标记技术 实验一 RAPD分子标记技术
实验目的
运用PCR-RAPD 分子标记技术，对不同种植物的基因组DNA进行PCR扩增，获得指纹图谱。同时运用统计分析方法，计算不同物种的遗传距离，得出物种间的亲缘关系。
实验原理
随机扩增多态性DNA（Random Amplification Polymorphic DNA）是建立在PCR技术之上的一种分子标记方法，它是以一系列不同随机排列的寡聚核酸单链为引物，对于所研究的基因组DNA进行扩增，扩增产物通过聚丙烯酰氨凝胶或者琼脂糖凝胶电泳分析，经EB染色来检测扩增产物的多态性。对于任一特定的RAPD引物，它同基因组DNA序列有特定的结合位点，这些位点在基因组某些区域内的分布符合PCR反应的条件，即随机引物在模板的两条链上有互补的位置，且引物的3’端相距在一定的长度范围之内，就可以扩增出来DNA片段，如果基因组在这些区域发生DNA的片段的插入或者缺失，或者碱基突变就能够导致这些特定结合位点分布发生变化，而使PCR产物增加或者减少，发生分子量的变化，通过对于PCR产物的检测分析即可以测出基因组在这些区域的多态性。
实验材料
土豆、玉米等农作物
试剂及仪器
10×buffer: 500mM KCl
100mM Tris-HCl (pH9.0) 0.1% 明胶 1% TritonX-100 MgCl2 2.5mM ４×dNTP: 1mM
引物： 3种RAPD引物 5.0uM 模板： 20ng/μl Taq酶： 5u/μl
PCR仪，凝胶成像系统，电泳系统
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实验方法
１．向无菌的500μl Eppendorf管中依次加入以下溶液。 反应物 体积 10×buffer 2.5μl 4×dNTP(1mM) 2.5μl MgCl2 (25mM) 2.5μl 无菌水 10.5μl Taq酶 (1U/ul) 1μl
引物 2μl 模板DNA(20ng) 4μl 总体积 25μl 反应体系混匀，离心
3．在ＰＣＲ仪上按以下方式循环 94℃变性 １分钟 36℃退火 １分钟 72℃延伸 ２分钟 经过40个循环
4．７２℃延伸反应7分钟。
5．取20μl反应液加4μl Loading buffer在 6. 1.5％琼脂糖凝胶上120伏，电泳2小时。 7. 在凝胶成像系统上观察记录实验结 8 数据处理与统计分析
用“1”(有) 和“0”(无) 记录谱带，把图形资料转换成数据资料。根据Jacard相似系数法，求得品种i 和j 之间的遗传相似性系数(F)，再根据D=1-F, 用SPSS软件进行聚类分析，构建分子进化系统树，进行遗传多样性和遗传关系分析。
结果分析
根据RAPD扩增结果计算: 1.遗传相似性系数 S S = 2 Nxy / (Nx + Ny)
Nxy为种间共有的扩增带，Nx为X种具有的扩增带，Ny为Y种具有的扩增带
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