消毒剂消毒效果及有效期确认
取0.5ml工作菌液加入下列溶液中 1 2 3 4 5 6 消毒剂4.5ml 消毒剂4.5ml 中和剂4.5ml 中和产物4.5ml（消毒液与中和剂比例为1:1） 稀释液4.5ml 稀释液4.5ml 10-2、10-3 10min 取混合液A 0.5ml加入下列溶液 稀释液4.5ml 中和剂4.5ml 稀释液4.5ml 稀释液4.5ml 10min B的稀释级溶液0.5ml平板计数（2皿/组） 混合液B、10-1 混合液B、10-1 10-2、10-3 10-2、0-3 稀释液和中和剂各1.0ml注入无菌平皿中，各制备2皿。 具体操作 ? 第1组
目的：观察消毒液对试验菌有无杀灭或抑制能力。 操作：
取消毒剂4.5ml+工作菌液0.5ml，混匀作用10min后，取混合液0.5ml+稀释液4.5ml，混匀作用10min，取0.5ml注皿，平行制备2皿。金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌芽孢菌用营养琼脂培养基，倒置30～35℃培养3天计数；白色念珠菌用玫瑰红钠琼脂培养基，倒置23～28℃培养5天计数计数。 ? 第2组
目的：观察残留消毒剂被中和后受到消毒剂作用后的试验菌是否恢复生长。 操作：
取消毒剂4.5ml+工作菌液0.5ml，混匀作用10min后，取混合液0.5ml +中和剂4.5ml，混匀作用10min，用稀释液稀释成10-1。分别取未稀释溶液（混合液0.5mll+中和剂4.5ml的混合液）及10-1 0.5ml注皿，各平行制备2皿。金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌芽孢菌用营养琼脂培养基，倒置于30～35℃培养3天计数；白色念珠菌用玫瑰红钠琼脂培养基，倒置于23～28℃培养5天计数。 ? 第3组
目的：观察中和剂是否有抑菌性 操作：
取中和剂4.5ml+工作菌液0.5ml，混匀作用10min，取混合液0.5ml l+稀释液4.5ml，混匀作用10min后，用稀释液进行10倍系列稀释成10-2、10-3。取相应稀释级0.5ml注皿，
11
消毒剂消毒效果及有效期确认
各稀释级平行制备2皿。金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌芽孢菌用营养琼脂培养基，倒置30～35℃培养3天计数；白色念珠菌用玫瑰红钠琼脂培养基，倒置30～35℃培养3天计数计数。 ? 第4组
目的：观察中和产物，或未被完全中和残留消毒剂对试验菌的生长繁殖是否有影响。 操作：
取消毒剂和中和剂1:1的混合液4.5ml+工作菌液0.5ml，混匀作用10min，取混合液0.5ml l+稀释液4.5ml，混匀作用10min后，用稀释液进行10倍系列稀释成10-2、10-3。取相应稀释级0.5ml注皿，各稀释级平行制备2皿。金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌芽孢菌用营养琼脂培养基，倒置30～35℃培养3天计数；白色念珠菌用玫瑰红钠琼脂培养基，倒置30～35℃培养3天计。 ? 第5组
目的：作菌落数对照用 操作：
取稀释液4.5ml+工作菌液0.5ml，混匀作用10min，取混合液0.5ml l+稀释液4.5ml，混匀作用10min后，用稀释液进行10倍系列稀释成10-2、10-3。取相应稀释级0.5ml注皿，各稀释级平行制备2皿。金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌芽孢菌用营养琼脂培养基，倒置30～35℃培养3天计数；白色念珠菌用玫瑰红钠琼脂培养基，倒置30～35℃培养3天计数。 ? 第6组
目的：作为阴性对照用
操作：分别取稀释液和中和剂各1.0ml注入无菌平皿中，各制备2皿。 结果判断
试验结果应符合下列全部条件，判断所选中和剂合格。 ? 第1组无菌生长，或仅有少数试验菌菌落生长。
? 第2组菌落数比第1组菌落数多，但比第3、4、5组菌落数少，且符合下表要求
第1组平板平均菌落数 0 x 第2组平板平均菌落数 〉5 〉(x+5) 12
消毒剂消毒效果及有效期确认
y 〉(y+0.5y) ? 第3、4、5组有相似菌落数生长，其每组间菌落数误差率不超过15%。计算公式如
下：
（3组间菌落平均数-各组菌落平均数）的绝对值之和
误差率＝————————————————————————×100％
3×3组间菌落平均数
第6组无菌生长。否则，说明试剂有污染，应重新进行试验。
7定量悬浮试验
0.2%新洁尔灭溶液、75%乙醇溶液消毒效力的确认（定量悬浮试验法）
目的：由于0.2%新洁尔灭溶液、75%乙醇溶液要通过浸泡或液封消毒，采用将消毒剂置于无菌具塞试管中通过定量悬浮试验法，确定其消毒效力是否符合要求。
程序：（1）菌种的选择 由于0.2%新洁尔灭溶液、75%乙醇溶液中低效消毒剂，且不能杀灭芽孢，故定量悬浮试验用菌为金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、白色念珠菌； （2）菌液制备：取金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌接种于营养肉汤培养基中，于30～35℃培养18～24h即得，培养后微生物浓度应不少于106cfu/ml。取白色念珠菌接种于改良马丁液体培养基中，于23～28℃培养24～48h即得，培养后微生物浓度应不少于106cfu/ml。 （3）消毒剂的配制：按照《清洁剂、消毒剂配制使用程序》进行配制0.2%新洁尔灭溶液、75%乙醇溶液，现配现用。
（4）试验方法：（a）在室温条件下将配制好的0.2%新洁尔灭溶液（或75%乙醇溶液）按9ml/支分注于27支无菌具塞试管中，按照“5分钟组”、“10分钟组”和“15分钟组”共3组每组9支，进行分组编号。
（b）取供试菌液（106cfu /ml的金黄色葡萄球菌菌液，106cfu /ml的大肠埃希菌菌液，106cfu /ml的白色念珠菌菌液）1ml按照下表，分别接入到盛有9ml0.2%新洁尔灭溶液（或75%乙醇溶液）的试管中（已进行10倍稀释），轻轻摇动，混合均匀，并立即开始计时。 金黄色葡萄球菌 5分钟组 10分钟组 15分钟组 1ml/支，共3支 1ml/支，共3支 1ml/支，共3支 13
消毒剂消毒效果及有效期确认
大肠埃希菌 白色念珠菌 （c） 消毒剂的稀释
分别在5分钟、10分钟和15分钟时迅速吸取1ml菌药混合液，加入到9ml（1%卵磷脂 +0.1%聚山梨酯80）中和剂中，迅速混匀中和10分钟，分别取上述经中和的“5分钟组”、“10分钟组”和“15分钟组”的接种细菌的消毒液，倾入过滤杯滤过，然后各用0.9%无菌生理盐水50ml清洗滤膜，滤过，重复用50ml0.9%无菌生理盐水的洗涤共3次。取下滤膜，含细菌的膜放入营养琼脂平板内，含真菌的膜放入玫瑰红钠琼脂平板内，含菌膜面向上。细菌于30-35℃的生化培养箱内培养3d，真菌于23-28℃的霉菌培养箱内培养5d。培养后在明亮处，对平板上的菌落数进行计数，记录计数结果。 d 阳性对照
分别将106cfu/ml金黄色葡萄球菌菌液、106cfu/ml大肠埃希菌菌液、106cfu/ml的白色念珠菌菌液用无菌注射用水进行梯度稀释至浓度为10～100cfu/ml，取稀释液体1ml于平皿中，倾注冷却至45℃营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基混匀，待凝固后于细菌于30-35℃的生化培养箱内培养3d，真菌于23-28℃的霉菌培养箱内培养5d。培养结束后对平板上的菌落数进行计数，记录计数结果。
0.2%新洁尔灭溶液消毒效力的确认
试验组菌落数（cfu/ml） 与消毒剂作用时间 菌种名称 1 金黄色葡萄球菌 5分钟 大肠埃希菌 白色念珠菌 金黄色葡萄球菌 10分钟 大肠埃希菌 白色念珠菌 金黄色葡萄球菌 15分钟 大肠埃希菌 白色念珠菌 10-1 2 3 平均菌落杀菌率 数（cfu/ml） 1ml/支，共3支 1ml/支，共3支 1ml/支，共3支 1ml/支，共3支 1ml/支，共3支 1ml/支，共3支 14
消毒剂消毒效果及有效期确认
稀释级 菌种名称 阳性对照 金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌 白色念珠菌 确认结果评价： 操作人： 日期： 年 月 日 复核人： 日期： 年 月 日 75%乙醇溶液消毒效力的确认 试验组菌落数（cfu/ml） 与消毒剂菌种名称 作用时间 1 金黄色葡萄球菌 5分钟 大肠埃希菌 白色念珠菌 金黄色葡萄球菌 10分钟 大肠埃希菌 白色念珠菌 金黄色葡萄球菌 15分钟 大肠埃希菌 白色念珠菌 稀释级 菌种名称 阳性对照 金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌 白色念珠菌 10-3 10-1 2 10-4 3 10-5 平均菌落杀菌率 数（cfu/ml） 平均菌落数（cfu/ml） 10 -310 -410 -5平均菌落数（cfu/ml） 15