二、实验室分离技术
(一)选择分离培养基
? 直接划线分离于麦康凯（MAC）及木糖赖氨酸去氧胆酸钠(XLD)，也可选志贺-沙门菌琼脂(SS) 、去氧胆酸钠硫化氢乳糖琼脂(DHL)、去氧胆酸钠柠檬酸盐琼脂(DCA)或海克顿肠道琼脂(HE)。 ? 但慎用SS，其可抑制志贺菌1型生长常造成漏检。
表2.志贺菌及大肠菌在选择培养基上菌落生长特征
选择性 培养基 MAC 志贺菌 菌落颜色、形态 无色、透明、光滑、湿润、边缘整齐、圆形 粉红或无色、透明、光滑、湿润、边缘整齐、圆形 无色、透明、光滑、湿润、边缘整齐、圆形 绿色、透明、光滑、湿润、边缘整齐、圆形 无色、透明、光滑、湿润、边缘整齐、圆形 菌落大小 2㎜～3㎜a，b 1㎜～2㎜a，c 2㎜～3㎜a 2㎜～3㎜a 1㎜～2㎜d 大肠埃希菌 菌落颜色、形态 粉红或红色、混浊、凸起、湿润、边缘整齐或不规则 黄色、混浊、凸起、湿润、边缘整齐或不规则 粉红色、混浊、凸起、湿润、边缘整齐或不规则 黄色、混浊、凸起、湿润、边缘整齐或不规则 粉红色、混浊、凸起、湿润、边缘整齐或不规则 菌落大小 3㎜～4㎜ 2㎜～3㎜ 3㎜～4㎜ 3㎜～4㎜ 2㎜～3㎜ XLD DCA HE SS 注：a：志贺痢疾菌1型菌落生长较小； b：不含结晶紫的市售培养基干粉不适 于志贺菌属的选择分离；c：志贺痢疾菌1型在XLD上生长菌落非常细小； d：志贺痢疾菌1型常被抑制生长。 木糖赖氨酸去氧胆酸钠琼脂（XLD)：木糖；赖氨酸5g；乳糖7.5g；蔗糖7.5g；去氧胆酸钠2.5g；硫代硫酸钠6.8g；柠檬酸铁铵；酚红。 去氧胆酸钠柠檬酸盐琼脂（DCA）:乳糖10g；去氧胆酸钠1g；柠檬酸铁1g；中性红0.03g。 (二)病原分离
? 用接种环多点沾取粪便标本中可疑部分,或用采样拭子涂种，直接划线分离选择琼脂平板各一块（见示意图4）；
? 36℃培养18～24小时。如无菌生长或接种过密应重新分离平板（可取菌苔处）（合格的分离平板菌落数>150个）。
图4 采样拭子接种平板及划线分离方法示意图
(三) 菌落生长特性
? 志贺菌属是需氧或兼性厌氧杆菌。
? 经37℃培养18～24小时，形成圆形、稍凸起、边缘整齐、表面光滑、湿润、无色、半透明、直径约2mm的较小菌落；
? 相对宋内菌的生长菌落较大、扁平，较不透明，易出现粗糙型菌落。 ? 志贺痢疾杆菌1型的营养需求比较高，必须补给15种氨基酸方能生长。 (四) 生化初筛
1.可疑菌落的观察和挑选：
? 许多细菌在选择性培养基上被抑制，既不发育也未死亡，有的能长出肉眼看不见的小菌落。
? 因而在观察、挑取可疑菌落时应用接种针挑取菌落中心，避免接触培养基表面以造成污染。 2.接种生化反应管：
? 从选择培养平板上挑取可疑菌落3-5个，用接种针挑取菌落中心，分别接种KIA和MIU；
? 先接种KIA(将接种针在其斜面上划直线，随之插入底层,取出后再在斜面上划密集的横线)，不经火焰直接穿刺接种MIU培养基； ? 置36℃±1℃培养16～20小时后观察结果。 3.生化反应鉴别：
? KIA：斜面－黄(分解乳糖产酸)／红(不分解乳糖)；
底部－红(产碱,非发酵菌)／黄(分解葡萄糖或乳糖)／产气／产H2S； ? MIU：动力(M)－沿接种线周围向外扩散生长呈现混浊者为阳性(用未接种MIU管对比观察)。 吲哚(I)－培养基变红为阳性。
尿素(U)－加0.5mlKovac’s试剂，数分钟内表层试剂变深红色为阳性。
表3.用克氏双糖(KIA) 和 动力-吲哚-尿素(MIU)生化反应
初步鉴别痢疾志贺菌与其它肠道菌
菌种名称 斜面 底层 H2S 动力 吲哚 尿素 氧化酶 A – – – – – + – + D + V + + + D D D – – + + – + D + + + – – – – – – – + + + – – – – – – – – – – – – – + + + 痢疾志贺菌(A群) K 福氏痢疾菌(B群) K 鲍氏痢疾菌(C群) K 宋内痢疾菌(D群) K 伤寒沙门菌 K A★ – A★★ – A A A A A A A A A A – +W – – D D – - – – 大肠碱性-殊异株 K 普罗菲登斯菌 摩根变形杆菌 雷极变形杆菌 K K K 小肠结肠炎耶氏菌 K 气单胞菌属 邻单胞菌属 弧菌属 K K K 爱德华氏菌属 哈夫尼亚菌属 K D ? A + + + + + – – – – – 注：K碱性反应（红色）；A产酸（黄色）；?产酸（黄色）＋产气；D不定（K或A）；W = 弱或迟缓 反应； ＊某些福氏6型产气；＊＊鲍氏痢疾菌血清13和14型产气；＊＊＊侵袭性大肠菌无动力。