PCR 培训教材
PCR基础理论
一、半保留复制及转录、逆转录
(1)DNA的半保留复制(semiconservative replication)
DNA是所有原核生物和真核生物遗传的主要物质基础。在这些生物中遗传信息以遗传密码的形式编码在DNA分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序,并通过DNA复制(replication)由亲代传给子代。在DNA合成进行时，以两条亲代DNA链中的每一条链为模板，在DNA指导下的DNA聚合酶催化下，按A与T、G与C碱基配对原则合成子代DNA的过程称DNA的复制。由于复制合成的子代DNA两条脱氧核糖核苷酸链中有一条来自亲代DNA，另一条是以前者为模板新合成的子代DNA链，所以DNA的这种合成作用又称半保留复制(图1)。
(2)RNA的转录（transcription）过程
以DNA为模板合成RNA的过程称为转录（transcription）。转录是生物界RNA合成的主要方式，是遗传信息由DNA向RNA传递过程，也是基因表达的开始。转录也是一种酶促的核苷酸聚合过程，所需的酶叫做依赖DNA的RNA聚合酶（DNA-dependent RNA polynerase ,DDRP）。转录产生初级转录物为RNA前体（RNA precursor），它们必须经过加工过程变为成熟的RNA，才能表现其生物活性。
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RNA的转录合成从化学角度来讲类似于DNA的复制，多核苷酸链的合成都是以5’→3’的方向，在3’-OH末端与加入的核苷酸磷酸二酯键，但是，由于复制和转录的目的不同，转录又具有其特点：（1）对于一个基因组来说，转录只发生在一部分基因，而且每个基因的转录都受到相对独立的控制；（2）转录是不对称的。（3）转录时不需要引物，而且RNA链的合成是连续的。
转录的主要过程分为识别与起始、延长和终止三个阶段。 (3)RNA的逆转录（reverse transcription）过程 以RNA为模板，根据碱基配对原则，按照RNA的核苷酸顺序(其中U与A配对)合成DNA。这一过程与一般遗传信息流转录的方向相反，故称为逆转录，催化此过程的DNA聚合酶叫做逆转录酶(reverse transcriptase)。
大多数反转录酶都具有多种酶活性，主要包括以下几种活性。①DNA聚合酶活性；以RNA为模板，催化dNTP聚合成DNA的过程。②RNase H活性；由反转录酶催化合成的cDNA与模板RNA形成的杂交分子，将由RNase H从RNA5′端水解掉RNA分子。③DNA指导的DNA聚合酶活性；以反转录合成的第一条DNA单链为模板，以dNTP为底物，再合成第二条DNA分子。除此之外，有些反转录酶还有DNA内切酶活性。反转录酶的发现对于基因工程技术起了很大的推动作用，目前它已成为一种重要的工具酶。?
二、PCR技术的基本原理与PCR技术的特点
聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR),又称无细胞分子克隆系统或体外酶促基因扩增法。PCR技术是由Kary B Mullis于1985年联合创造的。该技术可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍，从而大大提高对DNA分子的分析和检测能力，能检测单分子DNA或对每10万个细胞中仅含1个靶DNA分子的样品。
PCR技术的基本原理
其原理类似于DNA的天然复制过程，PCR由变性－退火－延伸三个基本反应步骤构成。
①模板DNA的变性
模板DNA经加热至93℃左右一段时间后，模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；
②模板DNA与引物的退火(复性)
模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；
③引物的延伸
DNA模板－引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性－退火－延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链‖,这种新链又可成为下次循环的模板，每完成一个循环需2－4分钟，2－3个小时就能将待扩目标基因扩增放大几百万倍。
PCR反应五要素
参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+。
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PCR反应条件
PCR反应条件为温度、时间和循环次数，温度、时间和循环次数的设置对PCR的成功与否至关重要。
1、温度与时间的设置
基于PCR原理三步骤而设置变性－退火－延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40 ～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因（长度为100～300bp）可采用二温度点法，除变性温度外，退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸（此温度TaqDNA酶仍有较高的催化活性）。
① 变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。
② 退火（复性）温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。
③ 延伸温度与时间：PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。
④ 循环次数：循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30～40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。
PCR反应特点 特异性强：PCR反应的特异性决定因素为：①引物与模板DNA特异正确的结合；②碱基配对原则；③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；④靶基因的特异性与保守性。其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。
灵敏度高：PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10- 12)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=-6)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒
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的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为3个细菌。
简便、快速：PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。
对标本的纯度要求低：不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。 三、PCR仪：
随着分子生物学的创立与发展，PCR测定方法作为一门崭新的技术已经在遗传疾病的诊断、临床标本中病原体核酸的检测、激活癌基因中突变情况的分析、法医学上的遗传学鉴定以及分子克隆诸方面得以越来越广泛的应用。实现这项技术的工具――PCR扩增仪也应运而生。
PCR扩增仪是整个PCR实验关键的仪器，它性能的好坏决定着实验结果的准确性。而仪器的恒温和变温的性能是决定基因片段完成变性、退火、延伸的最重要的参数。目前国内用户使用的PCR扩增仪品牌很多，原理和样本载量也不尽相同。下面测重给大家从恒温和变温两方面介绍各类扩增仪的原理：
1．梯度水浴法：这种方法一般是水浴槽加上机械臂结构。仪器上设有3个不同温度的水浴槽，通过机械臂携带样品管在这3个槽中浸泡，完成变性、退火、延伸3个过程。其优点是温度变化快，时间准确，温度可调，省时省力，价格较低。缺点是以室温温度为下限，不能实施复杂的操作过程。
2．空气驱动循环恒温装置：本系统用空气作为热传导媒介。外壳采用商品化的家用对流恒温器(烘箱)的外壳，热源包括两部分：强热气由热空气枪来提供，大功率风扇为制冷提供外部空气，或由冷室或更复杂设备产生冷空气。这种装置的优点是不用金属的精密加工，可使成本降低。整个系统不采用制冷液，安全程度高。同时以测定管内温度为控温依据，显示温度真实可靠。缺点是受环境温度影响大，各管的均一性需要严密的设计才能得以保证。
3．变温金属块作恒温装置：此类扩增仪中心是一个热块，上面均匀分布48或96孔，放专用的样品管，内壁加工精密，保证和反应管紧密接触。热块由其下部的电阻丝加热升温，并由微机控制恒温。冷却采用压缩机制冷，可快速制冷，温度变化速率大于1℃/秒。该系统用微机控制，扩增周期的循环条件可选择或编辑，程序可储存。该系统如有加热盖，样品管中则无需加入矿物油。
国内常见的PCR扩增仪：
由于各种PCR扩增仪的原理不同，其发热、制冷机制的方式都不尽相同。国外产品的特点是产品的质量和性能比较稳定。缺点是价格高，且维修麻烦。而国内仪器的性价比较高，售后服务快捷及时。
1、 9600型DNA扩增仪：(美国应用生物系统公司产品) 最大样本数：96孔。 温度范围：4℃－99℃。
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加热冷却速度：平均为1℃/秒。
温度精度：35℃－100℃间误差小于0.75℃。
特点：具有加热盖，可防止样品蒸发，可扩增微量至5ul的反应体积，记忆容量为150个用户文件。
2、 PTC-200热循环仪：（美国MJ Research公司产品） (1)最大样本数：96孔。
(2)温度范围：-5℃－105℃。
(3)加热冷却速度：平均为3.5℃/秒。
(4)温度精度：35℃－100℃间误差小于0.3℃。
(5)特点：采用可调压力和高度加热盖，样品管内无需加石蜡油，三种温控选择：模块、样本内参或电脑模拟计算。
3、 GeneStar9625扩增仪:(厦门安普利生物有限公司产品) (1)最大样本数：96孔。 (2)温度范围：4℃－100℃。
(3)加热冷却速度：平均为2℃/秒。
(4)温度精度：35℃－100℃间误差小于0.1℃。
(5)特点：具有加热盖，可防止样品蒸发，样品管内无需加石蜡油，全自动门，本机使用全自动智能化门，开始扩增时机门自动关闭，结束后机门自动打开，安全可靠。本机控制软件，充分考虑到PCR技术的最新进展的需要，允许用户对扩增各步条件任意修改，实现诸如Touch Down功能等。
目前国内比较流行的实时荧光定量PCR仪则是在PCR扩增仪的基础上加入了荧光检测系统，并由微机进行实时监控，使扩增检测一体化，我们将在后面为大家详细介绍PCR实时荧光定量技术。 四、PCR产物分析：
PCR产物是否为特异性扩增 ，其结果是否准确可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定，才能得出正确的结论。PCR产物的分析，可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。
① 凝胶电泳分析：PCR产物电泳，EB溴乙锭染色紫外仪下观察，初步判断产物的特异性。PCR产物片段的大小应与预计的一致，特别是多重PCR，应用多对引物，其产物片断都应符合预计的大小，这是起码条件。本方法包括琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。
②酶切分析：根据PCR产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶切、电泳分离后，获得符合理论的片段，此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究。
③ 分子杂交：分子杂交是检测PCR产物特异性的有力证据，也是检测PCR 产物碱基突变的有效方法。
④ Southern印迹杂交： 在两引物之间另合成一条寡核苷酸链(内部寡核苷酸)标记后做探针，与PCR产物杂交。此法既可作特异性鉴定，又可以提高检测PCR产物的灵敏度，还可知其分子量及条带形状，主要用于科研。
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