PCR 培训教材
且时隐时现，病情可持续很长。早期主要侵犯皮肤和粘膜，晚期侵犯心脏血管系统及中枢神经系统。梅毒可通过胎盘传给胎儿引起流产、早产、死产或分娩出先天性梅毒儿，若不经治疗半年内死亡。 1. 潜伏梅毒
感染梅毒后经一定活动期，或肌体免疫性增强，或由于治疗的影响，症状暂时消退但未痊愈，此阶段称为潜伏梅毒。将感染2年以内的潜伏梅毒定为早期潜伏梅毒，约有20%病人可发生二期复发梅毒。说明有传染性。2年以上者定为晚期潜伏梅毒，传染性较小，但10-20%可发生心血管或神经梅毒，10-15%可能 发生晚期 皮肤、 粘膜或骨骼梅毒。 早期潜伏梅毒的孕妇，会胎传给胎儿，故妊娠期内应进行治疗。 2. 妊娠梅毒
孕期发生活动性梅毒或潜伏梅毒称为妊娠梅毒。梅毒螺旋体可通过胎盘传给胎儿，引起胎盘坏死，导致流产、早产、或足月分娩先天梅毒儿。妊娠梅毒对母体和胎儿都是有害的 ，从优生优育考虑患梅毒妇女未经治愈前不能结婚并避免怀孕，如已妊娠应在妊娠早期接受充足治疗，防止胎儿被感染。
目前梅毒的主要检测方法有：
1） 检查梅毒螺旋体 选最适标本——下疳渗出液置于显微镜下观察运动活泼
的梅毒螺旋体，在光学显微镜下难以看清，需要在暗视野显微镜下观察。易与其他的螺旋体混淆，且医生工作强度大。
2） 非螺旋体抗原试验 国内常用USR和RPR试验，这类方法均用于初筛，一
期梅毒阳性率70%，二期可达100%，三期梅毒阳性率低。一些非梅毒疾患可能导致假阳性的产生。
3） 螺旋体抗原试验 用梅毒螺旋体抗原检测病人血清中抗梅毒螺旋体特异性
抗体，对梅毒感染的整体敏感性达98％以上，特异性可达99％，但对一期梅毒敏感性仅82％，在STD人群中会出现更高的假阳性反应，且非性病的密螺旋体也可以引起这类抗体。
4） PCR检测 PCR采用直接检测梅毒螺旋体的DNA，其敏感性、特异性更高，
可效防止交叉反应，对早期梅毒，特别是症状不典型的梅毒患者有较高的临床意义，且PCR法检测简便快速，整个过程仅需1.5小时左右，可以做到早期发现、早期治疗。
尖锐湿疣
由人类乳头瘤病毒引起。近20年来世界各地发病率迅速增加，我国亦然。该病潜伏期很长（1-8个月），大部分病人无症状，孕妇患此病婴儿通过产道可发生喉部感染导致喉部乳头瘤发生。该病复发率高，须定期复查。
该病实验室诊断有细胞学、组织病理学检查，免疫学实验，这些方法或繁琐或敏感性差而被更敏感的核酸检测技术取代。而在核酸检测技术中PCR以其方便、快速、特异、敏感 而最适用于临床。
性传播疾病的检查范围
性传播疾病的检测范围不只是病人以及高危人群。目前专家认为在婚前、产前、输血前后、升学、就业、参军 以及幼教老师等体检应做梅毒及其他性传播性疾病检
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测。
PCR在优生优育五项中的应用
沙眼衣原体
沙眼衣原体除致沙眼外，在临床上常引起泌尿生殖道感染，有时还可以引起不育，严重影响患者生活。发展的临床检测方法也有多种，其中培养法属金标准，但沙眼衣原体为专性细胞寄生性，一般培养不能生长，只在活细胞内才能增殖复制，较难直接用于临床检测，多用于科研；免疫学方法有直接免疫荧光测定，有一定主观因素；而EIA法，对高危人群筛查尚可，但易与金葡、链球菌、淋球菌等发生交叉反应使其特异性受影响。PCR检测克服以上诸方面不足，是目前较有发展前途的一种检测手段。当然，在使用中也有不足：易有假阳性和假阴性，但随着防污染盒的使用和其它技术的完善，以使该检测方法更适用于临床。
TORCH感染
TORCH感染是围产期慢性非细菌性感染，这些病原体通过孕妇的胎盘经血流，淋巴循环或污染的羊水感染胎儿。孕妇感染这些病原体后其自身绝大多数无明显症状，因此极易漏诊和误诊。但这些病原体经胎盘传给胎儿后危害很严重。使胎儿被感染导致流产、死胎、畸胎及先天性感染等。目前主要检查弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹I 病毒、单纯疱疹II病毒，即TORCH感染。TO即刚地弓形虫，R即风疹病毒，C即巨细胞病毒，H即单纯疱疹病毒I、II型。
弓 形 虫
弓形虫是一种寄生在人和动物组织细胞内的寄生虫。弓形虫病一般分为先天性和获得性两种。先天性弓形虫病是指母亲在妊娠期间感染弓形虫而发生虫血症经胎盘传给胎儿引起胎儿宫内感染，中枢神经系统是最受累的部位，其次为眼；获得性弓形虫病是经消化道感染，也可通过皮肤和粘膜感染，多发于轻壮年，淋巴结受累较多见，严重病例可侵犯多个器官。
本病广泛分布于世界各地，传染源主要为动物。
临床表现：1 先天性弓形虫病：脑病：小头畸形、脑积水、无脑儿；眼部：脉络膜视网膜炎、视神经炎、虹膜睫状体炎、白内障；2 获得性弓形虫病：低烧、淋巴结肿大。
风疹病毒
风疹病毒感染分为先天和后天两种，先天风疹综合症（congenital rubella syndrome CRS ）：孕妇妊娠头四个月感染风疹，病毒可经血流通过胎盘侵犯婴儿。除流产死产外，活产者部分可无症状，但相当部分表现出单个或多个器官受侵后的损害，观察时间愈长，异常率愈高。主要表现如下：
低体重：出生时常 ≦2500g，生后发育也缓慢。全身各器官损害导致的畸形或发育功能异常；白内障，视网膜、色素膜病，小眼，青光眼，角膜云翳，虹膜发育不全等；感觉性神经性耳聋或听力迟钝；持续性动脉导管未闭，肺动脉狭窄或发育不全，心肌损害；小头畸形，急性脑膜脑炎，智力低下，嗜睡，进行性全脑炎；肝脾肿大，黄疸，肝炎；血小板缺少性紫癜，骨髓外造血；间质性肺炎；其它晚
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期症状：糖尿病， 胸腺发育不全，甲状腺机能不全，生长激素缺乏。
巨细胞病毒
CMV是引起人类先天畸形的重要原因之一，在许多地区比风疹病毒更重要。孕妇的原发或新的复发感染均可引起胎儿宫内感染或新生儿围产期感染。 CMV先天感染的婴儿中约5%表现为典型的全身巨细胞包涵体病。严重的感染可使婴儿在数日或数周内死亡。5%的病例表现为非典型的临床表现。其余90%属亚临床型。新生儿巨细胞包涵体病的特症是网状内皮系统和中枢神精系统受侵，有的合并听觉系统损害。 有部分患儿临床表现轻微易被忽视或误诊，而到后期发生严重中枢神经系统损害。患CID的婴儿有90%以上在出生后二年发展成显著的智力或感知缺陷。 有的患儿发生严重听觉、视觉异常。亚临床感染预后较好，约有10%婴儿发生神经性耳聋，通常在2岁内发生，有的合并轻度脑功能障碍。
单纯疱疹病毒
单纯疱疹病毒分I 型和II型两种，型单纯疱疹病毒存在于女性阴道和宫颈，与宫颈癌的发生关系极为密切。孕早期感染者该病毒能破坏胚芽而导致流产，孕中晚期感染者虽然很少发生畸形，但可引起胎儿发病。新生儿可以在通过产道时获得感染。单纯疱疹病毒可引起角膜炎，其特点是分泌物少或无。复发性病变表现为树枝状角膜炎或角膜溃疡。病变可达角膜基层，引起角膜永久性混浊，甚至失明。
由于这些病原体感染的临床症状不典型，在临床诊断上就造成了一定的困难，所以以上疾病的诊断主要依靠实验室诊断。 PCR是通过对病原体基因中高保守特异性核酸序列的扩增来检测病原体是否在患者体内存在。 PCR技术在遗传性疾病方面的应用
遗传性的基因缺陷导致的疾病占人口总数1％，是临床中不可忽视的一类疾病。按遗传方式与遗传物质的关系，遗传病总括可分为单基因遗传病，多基因遗传病及染色体异常遗传病。遗传病是由基因在性细胞的突变引起的。突变可分为以下几类：1.基因取代；2.缺插性点突变；3.非编码序列的点突变；4.DNA重排。突变可以自发或诱导产生。
作为基因突变的检测，实验室较易做的基因分析，PCR方法使用主要可分为四种，分述如下。
一、 PCR结合等位基因特异性寡核苷酸（ASO）探针法 其原理基于对已知有突
变热点基因进行检测。用PCR扩增目的基因，将产物固定于尼龙膜上，针对各种常见突变点合成一系列正常及突变的寡核苷酸探针，将产物与探针杂交，利用非同源序列不能杂交的原理，可发现突变位点。
二、 PCR扩增特异等位基因（PASA） 其原理为引物3’末端的碱基决定PCR反
应特异性及扩增效率，引物3’末端碱基与模板相互配对时，Taq酶才能使引物延伸，产生特异PCR扩增产物。因此设计引物，使突变位点位于3’末端，根据特异性产物出现与否可判断样品中是否有基因突变存在。
三、 限制性片断长度多态性分析（PCR--RELP） 如果碱基突变位置与某种限制
性内切酶识别位点相关，突变会产生新的或消除原有内切酶位点。选用特定
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的限制性内切酶消化PCR产物，通过电泳酶切图谱可直接判断基因突变。
四、 单链构向多态分析（PCR—SSCP） 单链DNA呈复杂构象，空间结构依靠链
内碱基配对维系，聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据电泳迁移率的改变敏感地发现突变的存在。
除基因分析外，还可使用定序克隆或序列分析决定突变，但在技术上及设备上均要求较高，不是一种实验室易实践的方法。 地中海贫血 血友病 苯丙酮尿症 脆——X综合症 肿瘤（略）
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临床基因扩增检验实验室管理暂行办法
卫医发[2002]10号
第一章 总 则
第一条 为规范临床基因扩增检验实验室管理,保证临床基因扩增检验质量,使临床诊断和治疗更为科学、合理,特制定本办法。
第二条 临床基因扩增检验技术指以临床诊断治疗为目的,以扩增检测DNA或RNA为方法的检测技术,如聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)、转录依赖的放大系统(TAS)、自主序列复制系统(3SR)和链替代扩增(SDA)等。
第三条 本办法适用于开展临床基因扩增检验的实验室。 临床基因扩增检验实验室设立在二级以上医院。
第四条 临床基因扩增检验实验室必须使用经国家药品监督管理局批准的临床检验试剂开展临床基因扩增检验项目。
第五条 卫生部临床检验中心(以下简称卫生部临检中心)和省、自治区、直辖市临床检验中心(以下简称省临检中心)负责对所辖行政区域内临床基因扩增检验实验室的质量监督管理工作。
第二章实验室设置和验收
第六条 拟设置临床基因扩增检验实验室的医疗机构按照《临床基因扩增检验实验室基本设置标准》(见附件)筹建实验室;筹建完成后,由其法定代表人向卫生部临检中心提出技术验收申请。申请时需提交以下材料:
(一)〈医疗机构执业许可证〉复印件; (二)可行性研究报告:
1.拟设临床基因扩增检验实验室医疗机构的所在地医疗卫生资源、状况、本机构的基本情况、对临床基因扩增检验的需求情况以及临床基因扩增检验实验室运行的预测分析；
2..拟设临床基因扩增检验实验室的设置平面图;
3.拟设临床基因扩增检验实验室将开展的检测项目飞实验设备条件和有关技术人员资料。
第七条 卫生部临检中心和省临检中心共同组织相关专业的专家组(以下简称专家组)，按照《临床基因扩增检验实验室基本设置标准》对提出申请的临床基因扩增检验实验室进行技术验收。验收完成后,在20日内将验收报告寄送至申请机构。
第八条 经专家组技术验收合格的,医疗机构将本办法第六条规定的材料及专家组验收报告送省级卫生行政部门备案。在将符合规定的全部材料送达省级卫生行政部门备案后15日内,未收到省级卫生行政部门不同意的意见,方可开展专家组技术验收合格的临床基因扩增检验项目。
第九条 未经专家组验收合格并报省级卫生行政部门备案,医疗机构不得擅自开
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