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⑤ 斑点杂交： 将PCR产物点在硝酸纤维素膜或尼膜薄膜上，再用内部寡核苷酸探针杂交，观察有无着色斑点，主要用于PCR产物特异性鉴定及变异分析。
⑥ 核酸序列分析：是检测PCR产物特异性的最可靠方法。
⑦PCR－ELISA法：利用地高辛或生物素等标记引物，扩增产物被固相板上特异的探针所结合，再加入抗地高辛或生物素酶标抗体－辣根过氧化物酶结合物，最终酶使底物显色。常规的PCR－ELISA法只是定性实验，若加入内标，作出标准曲线，也可实现定量检测目的。
⑧荧光定量PCR法：
荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。
(1)荧光探针技术：在PCR扩增原理的基础上，根据扩增对象的序列，结合两侧引物的特征，在两条引物之间设计一条与扩增对象能特异性识别的荧光探针。探针采用双荧光标记技术，其5′端标记有报告基团(Reporter, R)，3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q)。当探针完整的条件下会产生荧光能量转移现象，即受激产生的荧光能量会被淬灭基团完全吸收，表现为报告基因受激后不能产生荧光的现象。而若PCR扩增过程中有特异性靶基因存在，荧光探针在退火过程中与目的基因特异性结合，PCR延伸过程中，当引物延伸到探针位置时，Tag酶便以其5′端的外切酶的活性将探针酶解，从而使5′端的报告基团脱离3′端的淬灭基团的抑制，恢复了荧光特性，在无须打开扩增管的情况下，通过适当的设备检测扩增后的荧光。该技术借助于荧光信号来检测PCR产物，一方面提高了灵敏度，另一方面还可以做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定CT值，从而根据CT值确定起始DNA拷贝数，做到了真正意义上的DNA定量。
(2)SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。 五、PCR应用注意事项：
PCR技术具有高度的特异性、选择性、灵敏性，而且快速、简便、易于自动化，因此在临床医学工作中受到广泛的重视及合理的应用。目前在我国许多基层医疗单位均已相继开展PCR研究应用工作。PCR技术很简单，原理也很清楚，因此有条件的单位都能较顺利地上马，但毕竟PCR技术是一种新生事物，受到许多条件因素的影响，所以要做得好也不容易。在PCR技术应用过程中会遇到这样或那样的问题，甚至会得到与事实完成相反的结果。
1、 假阳性扩增:
在实验过程中有时会碰到所检验的样本全部阳性，而且扩增产物电泳条带亮度均一，这是扩增系统受到污染时最典型的一种表现，需仔细检查，排除污染源。
⑴ 试剂污染：
检测方法，可按试剂盒使用说明书将试剂分装好，直接置于PCR仪中扩增（不加阴性对照，可加适量蒸馏水），便可简单而有效地判断试剂是否已受到污染。
⑵ 实验室污染：
这是最常见的污染源，由于PCR技术可以在几个小时内将模板中某些特异性序列
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扩增到数百万倍以上，扩增产物可能在电泳等过程中污染移液器、操作台或随着蒸发所形成气溶胶而污染整个实验室。扩增产物又是最有效的模板，一旦出现产物污染其污染程度都较严重。
判断方法：可以将实验中最关键步骤如试剂分装、样品处理等转移到一个新的环境中或转移到超净工作台中完成。当然，所用移液器、吸咀管（离心管）都应彻底更换。
解决方法：实验室污染是PCR扩增过程中最易出现的现象，而且一旦出现污染，消除污染源又极其困难，往往需对整个实验室及实验器材彻底清洗处理，所以应该以预防为主，实验过程中严格遵守实验基本要求，样品处理与扩增产物及电泳应尽量分开，最好能在两个房间进行。扩增前处理所用的移液器及扩增后点样用的移液器应严格地分开，不可互换。PCR室应保持良好的通风、清洁、最好能专用。
⑶ 采样污染：
在实验过程中，有时会出现一批结果阳性率很高，一批结果阳性率又下降很多，如此反复，这种现象主要是由于收集样本的试管或吸管受到污染所致。PCR扩增非常敏感，而一般实验室对重复使用的试管所进行的洗涤方法往往不能去除痕量DNA，这些痕量DNA便成为PCR模板，出现阳性扩增结果，由于采样试管受污染程度不一，所以出现忽高忽低的现象解决方法建议使用一次试管及吸咀取样。
2、 假阴性扩增：
如果连续几次扩增结果都是阴性，或已知阳性样本出现阴性扩增结果，一般认为这是假阴性，出现这现象有以下几种原因：
⑴ 仪器故障： 出现全阴结果，首先考虑到仪器运转是否正常。仪器运转是否正常是PCR扩增最关键的步聚之一。判断仪器是否正常，首先要测定加热体的温度是否准确，波动范围是否符合要求，各孔之间差异是否符合要求，PCR扩增往往对仪器加热温度及各管间的差异要求有很高的精度，如果误差太大，势必出现假阴性。
⑵ 试剂失效或无效： 确定所用仪器是正常的，便可对试剂进行检测。首先要了解试剂是否超过有效期，试存放方法是否达到要求，如果试剂盒在有效期内，贮存方法是正确，那么就应该仔细、慎重地判断试剂是否是无效试剂或称不合格试剂。可以用已知阳性样本，或试剂盒提供的阳性对照，严格按说明书操作扩增一次，然后把扩增产物用双蒸水稀释1000倍，作为模板进行第二次扩增，判断结果，如果是阴性说明试剂无效或不合格，如果结果阳性那么可用以下方法判定试剂的灵敏度。
⑶试剂的灵敏度：
有时试剂检测的阳性率偏低，所谓阳性率偏率就是指出现假阴性结果，这种现象往往与以下三种因素有关：①试剂质量不过关；②操作方法不规范；③主观判断标准不科学。对于试剂质量及操作是否正确这两点是比较容易检查并合理改进。对试剂敏感度的评价标准应该使用下述方法科学地评价，首先选择标准样本如HBV全序列质粒，标准阳性血清，结核菌菌体等用合适的介质如血清、痰液等进行有限稀释按1：10、1：100、1：1000、1：10000如此逐步提高稀释度价其试剂的敏感度，一般认为如果标准
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阳性乙肝的血清用正常血清稀释10000倍以上，结核菌每毫升中在100个左右仍能测出阳性结果时，试剂的敏感度是足够的，判断试剂的灵敏度是足够的，判断试剂的灵敏度后仍需判断试剂的检测覆盖，因为病原微生物有不同的型或变异株，合格的试剂不应漏检。最后还要判断试剂盒的异性，一般的实验室可以用不同病原体的样本按说明书操作来判断其对其它病原体扩增时是否也有阳性出现，其特异可达到怎样的精度，经过以上三个方面的研究便可以科学地判断试剂的质量。
3、 扩增产物拖尾:
有时扩增产物电泳后出现一个个荧光团（Smear现象）或出现一连串的条带，这些种现象主要与以下几种因素有关：
⑴ 扩增系统不完善：
这种现象表明出现非特异性扩增，而产生非特异性扩增与扩增系统中镁离子浓度、引物浓度、DNTP浓度有密切关系，需认真调整以期避免这种现象出现。另外也可以适当提高退火温度，从而提高扩增特异性。
⑵ 模板处理方法不完善：
PCR扩增技术的原理虽然非常简单，但这一技术的合理应用是极其复杂的，如对PCR主要成分之一DNA聚合酶的影响因素很多，这些因子是怎样作用于聚合酶，其作用机制至今仍不清楚，因此对样本处理不当不妥可能抑制扩增，也可能导致非特异扩增。一般分泌物样本，应取脱落细胞为主，避免采集过多的脓性分泌物，痰液样本一定要充分液化，等等。
⑶ 引物设计不合理：
引物与基因组之间的同源性是产生非特异性扩增的最主要原因，而我们一般在设计引物时往往只了解其基因组中的某一段序列，因此我们必须充分利用资料巧妙地设计出一组合理的引物，并通过反复比较、证实，最后才能确定其能否用于检测。
⑷ 产物电泳单萤光带及多萤光带
一般PCR扩增后，对扩增结果的判断最简单的方法是琼脂糖电泳，溴乙淀染色，在320nm的紫外激发观察其萤光条带，如果有明显和特异性扩增产物，就会在电泳平板预期的位置出现一条清晰的萤光亮带，按标准扩增系统配制的反应液，其引物浓度在0.1－0.5mM，一般经30个循环扩增后，仍有相当数量的游离引物存在，因此在电泳平板就有一条20BP左右（电泳速度较快）的淡淡的引物萤光带，这样每次电泳结果就有两条荥光带，一条在前面的，每个点样样本都有的引物带。
病原体变异，与前面所述一样，我们为得高敏感性经常使用具有重复序列的基因作为引物设计的区段，在有些病原体，比如结核杆菌在治病过程中，会发生严重畸变，也包括其遗传物质的变化，出现染色体的缺失、不等位交换、其它序列的插入等。如果这些缺失与不等位交换正好发生在我们所选择的扩增序列上，也会出现不同长度的扩增产物，从而产生多条扩增产物带。
PCR基因扩增技术简单易行，应用日趋广泛，但其影响因素很多，在实践过程中时常现现这样或那样的问题，甚至得不到预期的结果，或出现无法解释的现象。诚然，近年来在大量科学工作者的共同努力下，取得了许多宝贵的经验，使这一技术日趋完善，毕竟PCR是一项近几年才出现的新技术，许多问题至今仍然不能得到很好地解
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释或解决。想信随着对PCR的深入研究，在PCR的应用过程中不断总结经验，PCR这一新技术将会为人类的发展作出更大的贡献。 六、PCR模板制备
核酸模板是PCR扩增最重要的成份之一，PCR扩增技术对其模板DNA(RNA)的质量及数量要求不高，常规分子生物学方法对DNA及RNA的制备与纯化都足以达到要求。在目前临床PCR工作实践中样本大都有一个共同的特点就是微量，因此结合这一实际情况，及PCR扩增系统的特性，我们简单介绍几种临床常见标本的简化处理方法，可以在保证结果的前提下，省去许多繁琐的操作，相当实用。
一、白细胞（WBC）： 对巨细胞病毒（HCMV），免疫缺陷病毒（HIV），等病原微生物的检测，常需提取白细胞中病毒的模板，其处理方法如下：
⑴ 取200UL含50UL5％EDTA的抗凝血于0.5ml离心管中，1万转/分离心1分钟去上清。
⑵ 沉淀加入500UL 25mM TrisPH7.6、0.5％ Triton X-100，1.5万转/分离心1分钟去上清，重复本步聚一次。
⑶ 于沉淀中加入50UL样品处理液（厦门安普利生物工程有限公司提供），96℃加热10分钟。
⑷ 1.5万转/分离心10分钟，取上清10UL进行PCR扩增（扩增终体积为30UL）。 二、血清： 对乙肝（HBV），等病原微生物的检测，需要对血清样本进行处理，提取病原体模板。
⑴ 取100UL血清，加入50UL样品处理液混合。 ⑵ 96℃加热10分钟。
⑶ 1.5万转/分离心10分钟，取上清10UL进行PCR扩增。 三、痰液：
对结核杆菌（M.TB）等呼吸道感染病原微生物的检测需要取痰液样本。 ⑴ 痰液的液化，取晨起血丝痰或带干酷颗粒的痰样本约1ML，加入等量1N NaOH溶液，充分摇匀室温10-20分钟，若痰液浓稠时，可以适当增加1N NaOH溶液用量并延长时间或37℃水浴20分钟，使痰液充分液化。
⑵ 取中层液化良好的痰液1ml，1.5万转/分离心15分钟，去上清。
⑶ 1ml生理盐水或双蒸水将沉淀吹打混悬，充分摇匀，1.5万转/分离心15分钟，去上清。
⑷ 沉淀加入50UL样品处理液吹打混匀置96℃加热10分钟。 ⑸ 1.5万转/分离心10分钟，取上清10UL进行PCR扩增。 四、分泌物拭子： 对淋球菌（NG），沙眼衣原体（CT）等病原体进行检测时常需采用分泌拭子，对肺炎支原体、EB病毒等检测时常需采用咽部拭子采样，这些样本处理方法如下：
⑴ 取1ml生理盐水置1.5ml离心管中，充分洗涤分泌物拭子。 ⑵ 摇匀后取中层0.5ml，若分泌物较多只需200UL补加300UL生理盐水，于0.5ml
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离心管中。
⑶ 1.5万转/分离心10分钟，去上清。
⑷ 沉淀加入50UL样品处理液吹打混悬，96℃加热10分钟。 ⑸ 1.5万转/分离心10分钟，取上清10UL进行PCR扩增。 五、尿液、胸腹水、脑脊液沉淀等：
取样本1-1.5 ml于1.5ml离心管，1.5万转/分离心10分钟去上清，如果是检测结核杆菌，可将沉淀用1ml0.5N NaOH混悬室温静置10分钟，再进行洗涤，如果是淋球菌等样本可直接于沉淀中加入生理盐水1ml，充分摇匀，1.5万转/分离心10分钟去上清，重复洗涤一次，沉淀用50UL样品提取液吹打混匀，96℃加热10分钟，1.5万转/分离心10分钟，取上清10UL扩增。
六、RNA模板的制备
对于RNA病毒如丙肝病毒、柯萨奇病毒、流行性出血热病毒的检测，就必须制备病毒RNA模板，进行逆转录合成cDNA，然后进行PCR扩增。由于自然界存在大量的RNA酶，而对RNA酶的灭活又比较困难，所以能否避免RNA的污染是RNA模板成功制备的关键。
1、 酚氯方法：
① 取待测血清50UL加入100UL裂解液（厦门安普利生物工程有限公司提供），混匀后室温静置20分钟。
② 加入150UL酚：氯仿：异戍醇（50：49：1），混匀置室温10分钟，1.5万转/分离心15分钟。
③ 取水相50-100UL，加入等量异丙醇。
④ -20℃放置30分钟，1.5万转/分离心10分钟。 ⑤ 沉淀用预冷至-20℃的75％乙醇洗涤二次。 ⑥ 沉淀于50℃烘箱内干燥后即可扩增。 2、固相吸附分离法：
首先在乳胶颗粒或活化石英颗粒上接一个与欲提取的RNA互补的特异性探针（约50BP），利用它模板RNA杂交的原理使模板吸咐在固相颗粒上，从而达到分离提取的目的。
① 取待测血清50UL，加入裂解液100UL混匀，再加入适量带有探针的乳颗粒室温静置20-30分钟。
② 1万转/分离心1分钟，去上清。
③ 沉淀用预冷到至-20℃的75％乙醇洗涤二次。 ④ 沉淀于50℃烘箱内干燥后即可扩增。
PCR模板制备方法还有许多，到目前为止仍然没有任何一种方法能适用处理多种样本模板，只能在实际工作中不断积累经验，对现有方法进行改进，以期能更适合实验要求，以上所述的方法仅供参考。
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