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图3.分子信标杂交定量的原理 R：报告基团：Q：淬灭基团
后来，Nazarenko等基于MB的原理，使用了一种发卡引物式引物（Sunrise primer）,这一方法的特点是所有的扩增产物均能标记上荧光分子，因此荧光信号响反快，但无法共分特异和非特异扩增是其致命的不足。
图4 发卡引物PCR荧光定量原理 R：报告基团； Q：淬灭基团
最近 Whitcombe等上述方法进行了改进，发明了一种称之为蝎状引物（scorpion
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primer）的荧光定量PCR技术，该技术在引物与MB探针之间连接一个间隔臂，使PCR延伸反应时不能够延伸至MB分子，这样非特异扩增产物便无荧光信号，但当有特异扩增产物时MB即可与扩增产物进行分子内杂交，产生荧光信号。既解决了非特异问题，又保留了其响应快的特点。但是仍存在杂交时探针不能完与模板匹配及合成复杂的问题。该方法已成功地就髟于k-ras及BRAC2基因的突变分析[ ]
图5.蝎状引物PCR荧光定量原理
R：报告基团； Q：淬灭基团； S：间隔臂
5、Lightcycler技术
LightCycler是Roche公司新近开发的一种PCR定量技术，该技术的特点也是将荧光分子和淬灭分子分别标记在两个不同的探针上，产生发光探针和淬灭探针，发光探针的5’端连接荧光分子；淬灭探针的3’端连接荧光分子。由于两探针设计时可与模板同一条链相邻的序列杂交，杂交时两探针的荧光分子和淬来分子便紧密相邻，从而发生FRET而使荧光淬灭。荧光淬灭的程度与起始模板的量成反比，以此可以进行PCR定量分析。该方法的特点是淬灭效率高，但由于两个探针结合于模板上因此影响扩增效率，此外由于需要合成两个较长的探针，因此合成成本相对较高。
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图6.LightCycler探针荧光定量PCR原理
R：报告基团： Q：淬灭基团
二、内标在传统定量中的意义 1．几种传统定量PCR方法简介： 1）内参照法：
在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方法合成。上游引物用荧光标记，下游引物不标记。在模板扩增的同时，内标也被扩增。在PCR产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检测模板。 2）竞争法：
选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反应管中，待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增（其中一个引物为荧光标记）。扩增后用内切酶消化PCR产物，竞争性模板的产物被酶解为两个片段，而待测模板不被酶切，可通过电泳或高效液相将两种产物分开，分别测定荧光强度，根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数。 3）PCR－ELISA法：
利用地高辛或生物素等标记引物，扩增产物被固相板上特异的探针所结合，再加入抗地高辛或生物素酶标抗体－辣根过氧化物酶结合物，最终酶使底物显色。常规的PCR－ELISA法只是定性实验，若加入内标，作出标准曲线，也可实现定量检测目的〔6〕
。
2．内标在传统定量中的作用
由于传统定量方法都是终点检测，即PCR到达平台期后进行检测，而PCR经过对数期扩增到达平台期时，检测重现性极差。同一个模板在96孔PCR仪上做96次重复实验，所得结果有很大差异（见图4），因此无法直接从终点产物量推算出起始模板量。加入内标后，可部分消除终产物定量所造成的不准确性。但即使如此，传统的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。
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图4. 相同模板在同一台PCR仪上进行96次扩增的扩增曲线图
终点处检测产物量不恒定；Ct值则极具重现性
三．内标对荧光定量PCR的影响 1．实时荧光定量PCR无需内标
实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。因此，实时荧光定量PCR无需内标是建立在两个基础之上的： 1）Ct值的重现性
PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。（见图4） 2）Ct值与起始模板的线性关系
由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定，因此，实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。 2．内标对实时荧光定量PCR的影响
若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标，则PCR反应变为双重PCR，双重PCR反应中存在两种模板之间的干扰和竞争，尤其当两种模板的起始拷贝数相差比较大时，这种竞争会表现得更为显著。但由于待测样品的起始拷贝数是未知的，所以无法加入合适数量的已知模板作为内标。也正是这个原因，传统定量方法虽然加入内标，但仍然只是一种半定量的方法。
美国Texas大学的科研人员进行了外标法定量和内标法定量的方法学比较，得出的结论是：内标法作为定量或半定量的手段是不可靠的，而外标准曲线的定量方法是一种准确的、值得信赖的科学方。
Applied Biosystems公司的7700型实时荧光定量PCR仪是全球公认的荧光定量PCR的金标准，可实现多色荧光同时检测，但定量检测仍然采用外标准曲线的方法，而不用内标进行定量。
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综上所述，利用外标准曲线的实时荧光定量PCR是迄今为止定量最准确，重现性最好的定量方法，已得到全世界的公认，广泛用于基因表达研究、转基因研究，药物疗效考核、病原体检测等诸多领域。
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