PCR 培训教材
PCR技术在临床上的应用
随着分子医学及分子生物学的发展，在生物医学实验室诊断领域，发生了飞跃的变化，至此，自第一代的细胞形态学检验技术之后，发展到50年代生化指标作临床诊断疾病的依据，到60年代抗原抗体酶标记技术的迅猛发展形成了第三代免疫学诊断技术，到80年代初期基因重组技术的应用形成了第四代基因诊断技术。
在现代医学对疾病的诊断中，各种诊断技术密切配合，有机的结合在一起，构成了现代生物医学领域中最活跃的学科——临床实验诊断学的有机整体，为人类的健康发挥其重要作用。
从病原微生物检测角度看，PCR检验的应用以长程培养或无法分离培养者为优先考虑，如TB、衣原体、HPV、HBV 、HCV和军团菌。从遗传学考虑，则以有明确基因突变而引起疾病者适于此项检测。从肿瘤诊疗考虑可以研究发病机制及治疗中耐药问题。下面主要从传染病、性病、优生优育、遗传病、肿瘤五个方面举例PCR在临床检验中的应用。
PCR技术在传染性疾病方面的应用
乙型肝炎病毒 (HBV)
我国是乙肝高发区，乙肝病人占世界乙肝病人总数的50%，乙型肝炎对我国危害很大；乙型肝炎的病因学诊断和治疗效果的判定一直是医生和病人所关心的问题，目前乙型肝炎的实验室辅助诊断主要有：
1) 肝功能检测
主要依据谷丙转氨酶、谷草转氨酶是否异常，白球蛋白比例、总蛋白等指标判断患者的肝功情况， 2) 乙肝两对半
通过酶联免疫法检测HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb，依据阳性与否判断患者乙型肝炎病毒感染及传染性，常与肝功能检测进行综合评价。 3) PCR检测
PCR检测的是乙肝病毒DNA，是一种病因学诊断 ，它的优势表现在
（1）早期诊断 接种0.04μl的感染血液就足以导致传染，这么微量的病毒是
一般方法无法检测到的（酶免能测到0.1ng，核酸杂交能测到0.1pg，PCR能测到0.1fg）。PCR扩增极其敏感，理论上可检出100CID/ml乙肝病人血清，在感染潜伏期即可被PCR法检出。 （2）低复制持续感染乙肝病人的诊断 有些乙肝病人体内的病毒长期处于低复
制感染状态，血清病毒浓度极低。 （3）病情判断和疗效跟踪 PCR能判定病人血液中有否乙肝病毒及病毒含量，
从而得知病毒在肝脏的复制情况；定量PCR可测出病人血液中病毒的拷贝数，从而了解病毒在体内复制的动态情况，判断病情，观察药物疗效，适时调整治疗方案；还可以决定乙肝治疗的终点。 （4）乙肝病毒变异株的检测。
（5）肝炎病毒复制的直接实验室证据，可判断病毒携带者有否传染性。
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PCR结果与血清免疫学结果的综合评价
(一) HBV DNA 与 HBSAg/ HBSAb的关系
HBsAg阳性代表机体感染乙肝病毒，HBsAb的出现通常认为表示病毒已清除或既往感染或已接种过疫苗，患者自身有保护作用；但有报道HBsAg阴性而HBV DNA 阳性结果，可能原因是：
（1） 机体急性感染乙肝病毒期，HBSAg检测呈阳性通常需要经历所谓窗口期，而HBV DNA的检出可提前6~15天；
（2） HBsAg的水平过低造成无法检出，或者HBsAg确已消失但病毒仍处于低水平复制状态； （3） 暴发性乙型肝炎时肝细胞中以合成HBcAg为主，很少或不合成HBsAg; S区基因发生逃避免疫变异造成HBsAg阴性而HBV DNA 阳性； （4） 血清亚型的漏检；
（5） 老年人HBsAg检出率低于5%，处于HBV的低感染和高免疫状态，老年中HBV感染引起的慢性肝病，血清学表现不典型，病毒较多已发生变异，病毒免疫逃避而感染持久。
也有报道，HBsAb与HBV DNA 同时出现阳性，这一般发生在乙型肝炎感染窗口期，通常HBV DNA 检出率逐步下降。 (二) HBV DNA 与 HBeAg/ HBeAb的关系
HBeAg/ HbeAb分别是乙肝传染性及恢复早期的标志。HBeAg的出现通常是一过性阳性，HBeAg提示病毒复制和血清具有传染性。HBeAg消失和HBeAb出现，标志着病程进入了恢复期，通常认为将伴随临床及生化指征的消退。因此多数情况下，临床医生主要依靠HBeAg/ HBeAb状况来判断传染性，PCR技术的应用为评价HBV的传染性增加了一种手段。如前所述，HBeAg与HBV DNA两项标志的符合率很高，都指示HBV的复制及传染性。但PCR检测研究为抗HBe的意义带来了新观念。对于抗HBe和抗HBc慢性的病人，探针杂交和常规PCR方法检测HBV—DNA的阳性率分别为22%和33%。但PCR结合探针杂交法其阳性率达89%，几乎全部患者血清中都能检测到HBV-DNA。说明患者血清出现Hbe抗体后，虽然病情向好的方向转化，血液中的病毒可能减少，但并未完全消失。
丙型肝炎病毒
丙型肝炎病毒是一种单链正股RNA病毒，归类于黄病毒科，主要通过血液传播。此病毒呈全球性分布，无明确地理界限。全球约有1%的人感染此病，约50%以上慢性肝炎是由HCV感染引起的。我国由于对献血员筛选方法不够灵敏，急性病毒性肝炎中，输血后乙肝发病率占2/3,其余1/3为丙型肝炎，其中20—30%病人发展为肝硬化。因此，为保障血液安全，维护受血者的健康利益，寻找一种快速、简便、准确的诊断方法，对患者提供早期诊断，是时势所趋。
目前临床上常用的HCV检测方法主要有两类： 1) 血清学方法(EIA或RIA)测定抗HCV
抗HCV联免疫试剂是目前诊断丙肝的主要手段，普遍应用于检查血源和血液
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制品。但HCV抗体存在着较大局限性-----窗口期平均长达70天，不利于早期诊断；而且只代表既往感染，可在病毒清除后仍长时间存在，有报道说该时间可长达9年，无法准确判别抗-HCV阳性者是否有病毒血症。 2) 荧光PCR检测HCV RNA
血清中的HCV RNA是病毒复制和进程的确切标志。所以，检测血清HCV-RNA已成为诊断HCV病毒血症的“金标准”。HCV感染者血清病毒滴度通常很低，常规分子杂交技术难以检出HCV-RNA。近年发展的RT-PCR,巢式PCR技术将HCV-RNA的特异性和灵敏度大大提高，而荧光PCR的出现又将此技术推向了另一台阶。
通过荧光PCR的方法可以直接检测HCV-RNA,大大提高HCV感染的检测准确性，有利于疾病的早期诊断，可将窗口期缩短50多天，对窗口期感染的筛选和提高输血安全也非常有意义。此外，在抗病毒药物治疗中，HCV RNA是对其疗效评价的指标之一，其检测HCV RNA的滴度和基因型可对用药和预后提供参考。在治疗过程中，HCV RNA的动态监测同时还可为临床上的用药剂量、时间提供依据。
结核杆菌
近20年来，曾经控制在很低水平的结核病，在世界范围内有死灰复燃的趋势。我国卫生部组织的第四次全国结核病流行病学抽样调查显示：目前我国有4亿人感染过结核杆菌，现有传染性结核病人200万人，这使我国成为全球22个结核病高负担的国家之一，结核病人数位居世界第二，仅次于印度。结核病的致病菌是结核杆菌，主要通过呼吸道传播，亦可以从消化道进入人体，其对外界的抵抗力较强，在阴湿的地方可以存活5个月以上，带菌的痰液是结核杆菌的主要传染源。结核病尚有一个不同于其他传染病的特点：大多数人被感染上结核杆菌后并不马上发病，多数可以终生不发病。临床上常用的辅助检验方法主要有：
1） 涂片染色法
在结核杆菌的实验室检查中，直接涂片染色法找抗酸杆菌，报告查见抗酸杆菌或未查见抗酸杆菌，这种检查方法的特异性不高。其一，分枝杆菌的众多细菌都具有抗酸性，如果标本中混杂有非致病性分枝杆菌，可导致假阳性结果，所以单凭形态染色不能确定是不是结核杆菌；其二，直接涂片染色法灵敏度不高，每毫升痰中有10万个结核杆菌以上才能检出，且痰涂片抗酸染色镜检找结核杆菌，检验者需在同一张涂片上连续查找200~300个镜头，这大大加强了医生的工作强度。其三，TB特别是肺TB痰涂片，由于患者存在着间断排菌及痰液标本的取材与患者当时所处的疾病状态紧密相关，且治疗手段较以前进步，痰阴转率大大提高，这更显示出了痰涂片法的缺陷。目前临床标本常取早、中、晚深咳出的痰进行浓缩集菌后直接涂片，以提高其阳性率。 2) 培养法
结核杆菌培养法属金标准，但培养条件要求高、时间长、培养出菌落需要几周时间，不利于患者早期诊断、早期治疗。 3) 影像学
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胸部X线检查可以早期发现肺结核，而且对病灶部位、范围性质、发展情况
和治疗效果做出判断，但易与矽肺、肺癌等混淆。属于辅助性诊断，适用于集体性健康体检。
4) OT实验或PPD实验
OT实验或PPD实验均属于免疫学检测，其阳性只能证明患者接触过结核杆
菌或接种过疫苗，不能作为有效性诊断，仅作为参考。 5) PCR检测
PCR检测结核杆菌DNA是一种病因学检测，取材方便、简便快速，整个过
程仅需1个多小时，可以做到当天取材，当天检测，当天出结果，利于患者的早期诊断、早期治疗。而且目前荧光PCR检测的灵敏度和特异性极高，数据由计算机处理，客观公正，保证了诊断的准确性.
肺炎支原体
肺炎支原体以引起间质性肺炎为主，并有支气管肺炎，也称原发性非典型性肺炎。支原体肺炎是儿科常见传染病，约占儿童肺炎的10%，主要通过飞沫传播，成人偶发。在秋冬交接之季发病率高，该病症状较轻，多数不表现出任何症状，无特异性体征。
现阶段对于肺炎支原体感染的辅助诊断主要有：
1） 分离培养 将可疑患者的痰或咽拭接种进行培养，经较长时间后，分离出来
的支原体经形态、细胞吸附、生化反应及特异性抗血清作生长抑制试验（GIT）进行鉴定。此种方法耗时长，培养及检测鉴定都较为复杂。
2） 血清学检测 临床上常用冷凝集试验，但是阳性率比较低，约为50%。且
此反应是非特异性反应，呼吸道的其他疾病可能导致假阳性的产生。
3） ELISA实验 应用单克隆通过ELISA实验从患者的痰液、鼻洗液或支气管
洗液检测支原体的分子量。
4） PCR检测 从患者的痰中检测肺炎支原体DNA，可以从病因学上作出明确
的诊断，并可实时跟踪治疗效果。诊断方法科学简便，快速。 另外PCR尚可检测幽门螺杆菌、柯萨奇病毒、EB病毒、伤寒杆菌等。
PCR技术在性传播性疾病方面的应用
爱 滋 病
艾滋病是英语\中文名称，AIDS是获得性免疫缺陷综合征的英文缩写。它是由于感染了人类免疫缺陷病毒（简称HIV）后引起的一种致死性传染病。HIV主要破坏人体的免疫系统，使机体逐渐丧失防卫能力而不能抵抗外界的各种病原体，因此极易感染一般健康人所不易患的感染性疾病和肿瘤，最终导致死亡。一个感染上艾滋病病毒的人，也许会在很长的一段时间内看上去或是自我感觉起来很好，但是他们却可以把病毒传染给别人。艾滋病从发现至今还不到20年，但它在全球所引起的广泛流行，已使3000多万人受到感染，1000多万人失去了生命。目前，世界上每天有万余人新感染上艾滋病病毒。不但医学界在竭尽全力研究预防治疗艾滋，各国政府，社会各阶层也都纷纷投入了对抗艾滋病的运动。但到目前为止，我们人类还没有找到一种治疗此病的方法。因此，为了自身的健康和家庭的幸福，大家都应该关注艾滋病。
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了解艾滋病，进而预防艾滋病。
HIV的传播途径只有三个： 1）水平传播 2）血液传播 3）母婴垂直传播
爱滋病分布范围广，遍布全国的的20多个省市，感染者呈年轻化趋势，男女比例大致为：4~5：1，目前尚无一个比较好的检测方法，医学实验室常用检查主要有：
1）检测抗体 目前主要有ELISA、IFA、RIA、WB等，这些方法的敏感性都比较高，但是由于HIV的全病毒抗原与其他逆转录病毒存在交叉反应，HIV感染的淋巴细胞抗原与一些人血清中的抗HLA抗体存在交叉反应，故有一定的假阳性反应，因此此类实验仅适用于筛查HIV抗体，不宜用于确诊。
2）病毒分离 取新鲜的分离的正常人淋巴细胞或脐血淋巴细胞，用PHA刺激并培养，用以接种病人的血液，单个核细胞、骨髓细胞、脑脊液等标本。培养过程需要定期换液和补加PHA处理的新鲜正常人淋巴细胞，操作复杂，培养时间较长，需2~4周，不利于早期诊断。
3）测定病毒逆转录酶 主要测定病毒的逆转录酶的活性，可做定量测定，但其敏感性较低。
4）测定病毒抗原 常用ELISA法检测HIV的核心蛋白P24，这种抗原通常出现于疾病的急性感染期，潜伏期常为阴性，至感染发展爱滋病症状出现时，P24又可重新上升，由于潜伏期常为阴性，所以不利于爱滋病的预防控制及早期诊断。
5）PCR测定病毒核酸 运用PCR法检测HIV的RNA，可以检测出标本中微量的HIV基因组，属病因学检测，敏感度高，特异性好，几乎不存在交叉反应，且在患者早期就可作出诊断，大大缩短窗口期，利于爱滋病疫情蔓延的控制。
淋 病
性传播疾病是当今世界上广泛流行的传染病，其中淋病的发病率最高，临床上男性一般有典型症状，女性症状不典型或无症状，但可引起宫颈炎,尿道炎,子宫内膜炎,输卵管炎,盆腔炎,不孕症等多种妇科疾病。孕妇可经产道感染婴儿致淋菌性眼结膜炎。目前，淋病约占性病的70％以上，近年来我国的发病率呈上升趋势。发病人数每年以二三倍速度增加，而且逐渐由沿海地区向内地漫延，由城市向农村扩散。由于淋病的临床表现缺乏特异性，其确诊主要靠实验室检查，常用的方法有：
1） 临床标本涂片 在中性粒细胞中寻找革兰氏阴性双球菌的方法，简便易行，
但灵敏度不高，女性病人检出率仅50％左右。
2） 分离培养 目前难度不大，但其生化鉴定复杂，需要较长时间，达不到快
速检测目的。
3） PCR检测 直接检测细菌的DNA,实现了快速、特异、敏感地检测和鉴定淋
球菌的目的。可对分离培养的菌株进行鉴定和进一步分析，提高检测临床标本的阳性率和准确性，同时还可作为抗生素治疗的疗效观察。
梅 毒
由梅毒螺旋体引起。是性传播疾病中危害较大的一种疾病。症状表现多样化，
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