实验九 酵母蔗糖酶的提取及其性质的研究
本实验为学生提供一个较全面的实践机会，学习如何提取纯化、分析鉴定一种酶，并对这种酶的性质，尤其是动力学性质作初步的研究。
自1860年Bertholet从酒酵母Sacchacomyces Cerevisiae中发现了蔗糖酶以来，它已被广泛地进行了研究。蔗糖酶（invertase）（?—D—呋喃果糖苷果糖水解酶）（fructofuranoside fructohydrolase）（EC.3.2.1.26）特异地催化非还原糖中的?—呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。
本实验提取啤酒酵母中的蔗糖酶。该酶以两种形式存在于酵母细胞膜的外侧和内侧，在细胞膜外细胞壁中的称之为外蔗糖酶（external yeast invertase）, 其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50% 糖成分的糖蛋白。在细胞膜内侧细胞质中的称之为内蔗糖
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酶（internal yeast invertase），含有少量的糖。两种酶的蛋白质部分均为双亚基，二聚体，两种形式的酶的氨基酸组成不同，外酶每个亚基比内酶多两个氨基酸，Ser和Met，它们的分子量也不同，外酶约为27万(或22万，与酵母的来源有关)，内酶约为13.5万。尽管这两种酶在组成上有较大的差别，但其底物专一性和动力学性质仍十分相似，因此，本实验未区分内酶与外酶，而且由于内酶含量很少，极难提取，本实验提取纯化的主要是外酶。
两种酶的性质对照表如下： 名称 外酶 内酶 MW 27万(22万) 13.5万 糖含量 50% ＜3% 亚基 双 双 底物底物为蔗为棉糖的 子 糖Km 的Km 26mM 150 mM 25mM 150 mM 等电点 pI 5.0 最适 pH 4.9(3.5～5.5) 4.5(3.5 ～5.5) 稳定 pH 范围 3.0～7.5 6.0～9.0 最适温度 60℃
实验中，用测定生成还原糖（葡萄糖和果糖）的量来测定蔗糖水解的速度，在给定的实验条件下，每分钟水解底物的量定为蔗糖酶的活力单位。比活力为每毫克蛋白质的活力单位数。
本实验共有九个分实验： 一、蔗糖酶的提取与部分纯化 二、离子交换柱层析纯化蔗糖酶
三、蔗糖酶各级分活性及蛋白质含量的测定 四、反应时间对产物形成的影响
五、pH对酶活性的影响和最适pH的测定 六、温度对酶活性的影响和反应活化能的测定
七、底物浓度对催化反应速度的影响及米氏常数Km和最大反应速度Vmax的测定 八、尿素（脲）抑制蔗糖酶的实验 九、棉子糖和果糖抑制蔗糖酶的实验
（一） 蔗糖酶的提取与部分纯化
一、实验目的：
学习酶的纯化方法，并为动力学实验提供一定量的蔗糖酶。
二、试剂：
1. 啤酒酵母 2. 二氧化硅
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3. 甲苯（使用前预冷到0℃以下） 4. 去离子水（使用前冷至4℃左右） 5. 冰块、食盐 6. 1N乙酸 7. 95%乙醇
三、仪器：
1. 研钵1个 2. 离心管3个 3. 滴管3个
4. 量筒50ml 1个 5. 水浴锅1个 6. 恒温水浴
7. 烧杯100ml 2个 8. 广泛pH试纸 9. 高速冷冻离心机
四、操作步骤：
1. 提取
（1）准备一个冰浴，将研钵稳妥放入冰浴中。
（2）称取5g干啤酒酵母和20g湿啤酒酵母，称20mg蜗牛酶及适量（约10g）二氧化硅，放入研钵中。二氧化硅要予先研细。
（3）量取预冷的甲苯30ml缓慢加入酵母中，边加边研磨成糊状，约需60分钟。研磨时用显微镜检查研磨的效果，至酵母细胞大部分研碎。
（4）缓慢加入预冷的40ml去离子水，每次加2ml左右，边加边研磨，至少用30分钟。以便将蔗糖酶充分转入水相。
（5）将混合物转入两个离心管中，平衡后，用高速冷离心机离心，4℃，10000rpm，10min。如果中间白色的脂肪层厚，说明研磨效果良好。用滴管吸出上层有机相。 （6）用滴管小心地取出脂肪层下面的水相，转入另一个清洁的离心管中，4℃，10000rpm，离心10min。
（7）将清液转入量筒，量出体积，留出1.5ml测定酶活力及蛋白含量。剩余部分转入清洁离心管中。
（8）用广泛pH试纸检查清液pH，用1N乙酸将pH调至5.0，称为“粗级分I”。 2. 热处理
（1）予先将恒温水浴调到50℃，将盛有粗级分I的离心管稳妥地放入水浴中，50℃下保温30分钟，在保温过程中不断轻摇离心管。
（2）取出离心管，于冰浴中迅速冷却，用4℃，10000rpm，离心10min。
（3）将上清液转入量筒，量出体积，留出1.5ml测定酶活力及蛋白质含量（称为“热级分II”）。 3. 乙醇沉淀
将热级分II转入小烧杯中，放入冰盐浴（没有水的碎冰撒入少量食盐），逐滴加入
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等体积预冷至－20℃的95%乙醇，同时轻轻搅拌，共需30分钟，再在冰盐浴中放置10分钟，以沉淀完全。于4℃，10000rpm，离心10min，倾去上清，并滴干，沉淀保存于离心管中，盖上盖子或薄膜封口，然后将其放入冰箱中冷冻保存（称为“醇级分Ⅲ”）。 废弃上清液之前，要用尿糖试纸检查其酶活性（于下一个实验一起做）。
（二）离子交换柱层析纯化蔗糖酶
一、试剂
1. DEAE纤维素：DE-23 1.5克
2. 0.5N NaOH 100ml 3. 0.5 N HCL 50ml
4. 0.02 mol/L pH 7.3 Tris-HCl 缓冲液250ml
5. 0.02 mol/L pH7.3（含0.2 mol/L浓度NaCl）的Tris-HCl缓冲液 50ml
二、仪器
1. 层析柱
2. 部分收集器
3. 磁力搅拌器及搅拌子 4. 50ml小烧杯2个 5. 玻璃砂漏斗
6. 真空泵与抽滤瓶
7. 精密pH试纸或pH计 8. 三通管 9. 止水夹 10. 吸耳球 11. 塑料紫外比色杯 12. 电导率仪 13. 尿糖试纸 14. 点滴板
三、操作步骤
1. 离子交换剂的处理：
称取1.5克DEAE纤维素（DE-23）干粉，加入0.5mol/L NaOH溶液（约50ml），轻轻搅拌，浸泡至少0.5小时（不超过1小时），用玻璃砂漏斗抽滤，并用去离子水洗至近中性，抽干后，放入小烧杯中，加50ml 0.5 mol/L HCl, 搅匀，浸泡0.5小时，同上，用去离子水洗至近中性，再用0.5 mol/L NaOH重复处理一次，用去离子水洗至近中性后，抽干备用。（因DEAE纤维素昂贵，用后务必回收）。实际操作时，通常纤维素是已浸泡过回收的，按“碱→酸”的顺序洗即可，因为酸洗后较容易用水洗至中性。碱洗时因过滤困难，可以先浮选除去细颗粒，抽干后用0.5 mol/L NaOH－0.5 mol/L NaCl 溶液处理，然后水洗至中性。 2. 装柱与平衡：
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先将层析柱垂直装好，在烧杯内用0.02 mol/L pH 7.3 Tris-HCl 缓冲液洗纤维素几次，用滴管吸取烧杯底部大颗粒的纤维素装柱，然后用此缓冲液洗柱至流出液的电导率与缓冲液相同或接近时即可上样。
3. 上样与洗脱：
上样前先准备好梯度洗脱液，本实验采用20ml 0.02M pH7.3的Tris-HCl缓冲液和20ml含0.2M浓度NaCl的0.02mol/L pH7.3的Tris-HCl缓冲液，进行线性梯度洗脱。取两个相同直径的50ml小烧杯，一个装20ml含NaCl的高离子强度溶液，另一个装入20ml低离子强度溶液，放在磁力搅拌器上，在低离子强度溶液的烧杯内放入一个小搅拌子（在细塑料管内放入一小段铁丝，两端用酒精灯加热封口），将此烧杯置于搅拌器旋转磁铁的上方。将玻璃三通插入两个烧杯中，上端接一段乳胶管，夹上止水夹，用吸耳球小心地将溶液吸入三通（轻轻松一下止水夹），立即夹紧乳胶管，使两烧杯溶液形成连通，注意两个烧杯要放妥善，切勿使一杯高、一杯低。
用5ml 0.02mol/L pH7.3的Tris-HCl缓冲液充分溶解醇级分Ⅲ，（注意玻璃搅棒头必须烧园、搅拌溶解时不可将离心管划伤），若溶液混浊，则用小试管，4000rpm离心除去不溶物。取1.5ml上清液（即醇级分Ⅲ样品，留待下一个实验测酶活力及蛋白含量），将剩余的3.5ml清液小心地加到层析柱上，不要扰动柱床，注意要从上样开始使用部分收集器收集，每管2.5~3.0ml/10min。上样后用缓冲液洗两次，然后再用约20ml缓冲液洗去柱中未吸附的蛋白质，至A280降到0.1以下，夹住层析柱出口，将恒流泵入口的细塑料导管放入不含NaCl的低离子强度溶液的小烧杯中，用胶布固定塑料管，接好层析柱，打开磁力搅拌器，放开层析柱出口，开始梯度洗脱，连续收集洗脱液，两个小烧杯中的洗脱液用尽后，为洗脱充分，也可将所配制的剩余30ml高离子强度洗脱液倒入小烧杯继续洗脱，控制流速2.5~3.0ml/10min。
测定每管洗脱液的A280光吸收值和电导率。（使用DJS-10电导电极）
测定不含NaCl的0.02mol/L pH7.3 Tris-HCl缓冲液和含0.2mol/L浓度NaCl的0.02mol/L pH7.3 Tris-HCl缓冲液的电导率，用电导率与NaCl浓度作图，利用此图将每管所测电导率换算成NaCl浓度，并利用此曲线估计出蔗糖酶活性峰洗出时的NaCl浓度。 4. 各管洗脱液酶活力的定性测定
在点滴板上每一孔内，加一滴0.2mol/L pH4.9的乙酸缓冲液，一滴0.5mol/L蔗糖和一滴洗脱液，反应5分钟，在每一孔内同时插入一小条尿糖试纸，10～20min后观察试纸颜色的变化。用“+”号的数目，表示颜色的深浅，即各管酶活力的大小。合并活性最高的2~3管，量出总体积，并将其分成10份，分别倒入10个小试管，用保鲜膜封口，冰冻保存，使用时取出一管。此即“柱级分IV”。
注意：从上样开始收集，可能有两个活性峰，梯度洗脱开始前的第一个峰是未吸附物，本实验取用梯度洗脱开始后洗下来的活性峰。 在同一张图上画出所有管的酶活力，NaCl浓度（可用电导率代替）和光吸收值A280的曲线和洗脱梯度线。
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