（三）蔗糖酶各级分活性及蛋白质含量的测定
一、实验目的
掌握蔗糖酶活性测定方法，了解各级分酶的纯化情况。
二、原理
为了评价酶的纯化步骤和方法，必须测定各级分酶活性和比活。
测定蔗糖酶活性的方法有许多种，如费林试剂法、Nelson’s试剂法、水杨酸试剂法等，本实验先使用费林试剂法，以后测米氏常数Km和最大反应速度Vmax时再用Nelson’s试剂法。
费林试剂法灵敏度较高，但数据波动较大，因为反应后溶液的颜色随时间会有变化，因此加样和测定光吸收值时最好能计时。其原理是在酸性条件下，蔗糖酶催化蔗糖水解，生成一分子葡萄糖和一分子果糖。这些具有还原性的糖与碱性铜试剂混合加热后被氧化，二价铜被还原成棕红色氧化亚铜沉淀，氧化亚铜与磷钼酸作用，生成兰色溶液，其兰色深度与还原糖的量成正比，于650nm测定光吸收值。
三、试剂
1. 碱性铜试剂（用毕回收）
称10g无水NaCO3 ,加入100ml去离子水溶解，另称1.88g酒石酸，用100ml去离子水溶解，混合二溶液，再加入1.13克结晶CuSO4，溶解后定容到250ml。
2. 磷钼酸试剂（用毕回收）
在烧杯内加入钼酸17.5g，钨酸钠2.5g，10% NaOH 100ml, 去离子水100ml，混合后煮沸约30min（小心不要蒸干），驱去钼酸中存在的氨，直到无氨味为止，冷却后加85%磷酸63ml,混合并稀释到250ml。
3. 0.25%苯甲酸200ml，配葡萄糖用，防止时间长溶液长菌，也可以用去离子水代替。 4. 葡萄糖标准溶液：
（1）贮液：精确称取无水葡萄糖（应在105℃恒重过）0.1802克，以0.25%苯甲酸溶液溶解后，定容到100ml容量瓶中（浓度10mmol/L）。
（2）操作溶液：用移液管取贮液10ml，置于50ml容量瓶中，以用0.25%苯甲酸或去离子水稀释至刻度（浓度为2mmol/L）。
5. 0.2mol/L蔗糖溶液50ml，分装于小试管中冰冻保存，因蔗糖极易水解，用时取出一管化冻后摇匀。
6. 0.2mol/L乙酸缓冲液，pH4.9，200ml。
7. 牛血清清蛋白标准蛋白质溶液（浓度范围：200～500?g/ml，精确配制50ml）。 8. 考马斯亮兰G-250染料试剂，100mg考马斯亮兰G-250全溶于50ml 95%乙醇后，加入120ml 85%磷酸，用去离子水稀释到1L（公用）。
四、仪器
1. 试管20支，试管架1个 2. 秒表1块，或用手表。 3. 移液管：0.1、0.2、2.0、5.0ml
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4. 塑料可见比色杯（杯上和器皿染色后可用少量95% 的乙醇荡洗） 5. 水浴锅 6. 电炉 7. 保鲜膜 8. 橡皮筋
五、各级分蛋白质含量的测定
采用考马斯亮兰染料法（Bradford法）的微量法测定蛋白质含量，参见 实验－“蛋白质含量的测定法”（因Tris会干扰Lowry法的测定）。标准蛋白的取样量为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0ml，用去离子水补足到1.0ml。
各级分先要仔细寻找和试测出合适的稀释倍数，并详细记录稀释倍数的计算（使用移液管和量筒稀释）。下列稀释倍数仅供参考： 粗级分 I： 10～50倍 热级分II： 10～50倍
醇级分III： 10～50倍 柱级分IV： 不稀释
确定了稀释倍数后，每个级分取3个不同体积的样进行测定，然后取平均值，计算出各级分蛋白质浓度。
六、级分I、II、III蔗糖酶活性测定
用0.02mol/L pH4.9乙酸缓冲液（也可以用pH5～6的去离子水代替）稀释各级分酶液，试测出测酶活合适的稀释倍数： I ： 1000～10000倍 II ： 1000～10000倍 III ： 1000～10000倍 以上稀释倍数仅供参考。
按“表1”的顺序在试管中加入各试剂，进行测定，为简化操作可取消保鲜膜封口，沸水浴加热改为用90～95℃水浴加热8～10min。
七、柱级分IV酶活力的测定
1. 酶活力的测定参照“表1”设计一个表格，反应混合物仍为1ml。
2. 第1管仍为蔗糖对照，9、10管为葡萄糖的空白与标准，与“表1”中的11、12管相同。
3. 2～7管加入柱级分IV（取样前先试测出合适的稀释倍数），分别为0.02 ml、0.05 ml、0.1 ml、0.2 ml、0.4 ml和0.6ml，然后各加0.2ml乙酸缓冲液（0.2mol/L pH4.9），每管用去离子水补充到0.8ml。
4. 1~7管各加入0.2 ml 0.2mol/L的蔗糖，每管由加入蔗糖开始计时，室温下准确反应10min，立即加入1ml碱性铜试剂中止反应，然后按“表1”中的步骤进行测定。
5. 第8管为0时间对照，与第7管相同，只是在加入0.2ml蔗糖之前，先加入碱性铜试剂，防止酶解作用。此管只用于观察，不进行计算。 6. 计算柱级分IV的酶活力： Units / ml原始溶液。
7. 以每分钟生成的还原糖的?moles数为纵座标，以试管中1ml反应混合物中的酶浓
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度（mg蛋白/ml）为横座标，画出反应速度与酶浓度的关系曲线。
表 1 级分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的酶活力测定 各管名称→ 对照 粗级分Ⅰ 热级分Ⅱ 醇级分Ⅲ 葡萄糖 管数→ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 0.0 0.05 0.20 0.50 0.05 0.20 0.50 0.05 0.20 0.50 / / 酶液(ml) H2O(ml) 0.6 0.55 0.40 0.10 0.05 0.20 0.10 0.55 0.40 0.10 1.0 0.8 乙酸缓冲液 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 / / (0.2mol/L pH4.9) / / / / / / / / / / / 0.2 葡萄糖2mmol/L 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 / / 蔗糖0.2mol/L 加入蔗糖，立即摇匀开始计时，室温准确反应10min后，立即加碱性铜试剂中止反应。 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 碱性铜试剂 用保鲜膜封口，扎眼，沸水浴加热8min，立即用自来水冷却。 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 磷钼酸试剂 H2O 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 A650nm E’=μmol/min·ml 平均E’ μmol/min·ml Units/ml原始组分
稀释后酶液的活力(按还原糖计算)：
E'?A650?0.2?2μmoles（）A'650?10?Bmin?ml 式中： A650 ──第2~10管所测A650 A’650──第12管所测A650
0.2 ── 第12管葡萄糖取样量
2 ── 标准葡萄糖浓度2mmol/L = 2μmol/ml
10 ──反应10min B ──每管加入酶液ml数
原始酶液的酶活力 E = (平均E’/2)×稀释倍数（Units / ml原始组分）
八、计算各级分的比活力，纯化倍数及回收率，并将数据列于下表：
为了测定和计算下面纯化表中的各项数据，对各个级分都必须取样，每取一次样，对于下一级分来说会损失一部分量，因而要对下一个级分的体积进行校正，以使回收率的计算不致受到不利的影响。
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酶的纯化表如下： 级记录校正蛋白质 分 体积 体积 (mg/ml) (ml) (ml) Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 总蛋白(mg) Units/ml 总 Units 比活 Units/mg 纯化倍数 1.0 回收率% 100
［注］：一个酶活力单位Units，是在给定的实验条件下，每分钟能催化1?mole蔗糖水解所需的酶量，而水解1?mole蔗糖则生成2?moles还原糖，计算时请注意。 下面是对假定的各级分记录体积进行校正计算的方法和结果： 记录体积 取样体积 级分 ml 核正体积计算 ml 15 15 1.5 Ⅰ 13.5 1.5 Ⅱ 13.5×(15/13.5) 5 1.5 Ⅲ 5×(15/13.5)×(13.5/12) 6 Ⅳ 6×(15/13.5)×(13.5/12)×(5/3.5 ) ──
校正后体积 ml 15.00 15.00 6.25 10.71 （四） 反应时间对产物形成的影响
酶的动力学性质分析，是酶学研究的重要方面。下面将通过一系列实验，研究pH、温度和不同的抑制剂对蔗糖酶活性的影响，测定蔗糖酶的最适pH、最适温度、蔗糖酶
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催化反应的活化能，测定米氏常数Km、最大反应速度Vmax和各种抑制剂常数KI ，由此掌握酶动力学性质分析的一般实验方法。
本实验是以蔗糖为底物，测定蔗糖酶与底物反应的时间进程曲线，即在酶反应的最适条件下，每间隔一定的时间测定产物的生成量，然后以酶反应时间为横座标，产物生成量为纵座标，画出酶反应的时间进程曲线，由该曲线可以看出，曲线的起始部分在某一段时间范围内呈直线，其斜率代表酶反应的初速度。随着反应时间的延长，曲线斜率不断减小，说明反应速度逐渐降低，这可能是因为底物浓度降低和产物浓度增高而使逆反应加强等原因所致，因此测定准确的酶活力，必须在进程曲线的初速度时间范围内进行，测定这一曲线和初速度的时间范围，是酶动力学性质分析中的组成部分和实验基础。 实验方法见“表2”：
1. 准备12支试管，按“表2”进行测定。用反应时间为0的第一管作空白对照，此试管要先加碱性铜试剂后加酶。第10支试管是校正蔗糖的酸水解。用第11管作为对照，测定第12管葡萄糖标准的光吸收值，用以计算第2～9各测定管所生成还原糖的“?moles”数。
2. “表2”中底物蔗糖的量为每管0.25 ?moles，全部反应后可产生0.5?moles的还原糖，所有的蔗糖和酶浓度应使底物在20min内基本反应完。
3. 画出生成的还原糖的?moles数（即产物浓度?moles/ml）与反应时间的关系曲线，即反应的时间进程曲线，求出反应的初速度。
表 2 反应时间对产物浓度的影响 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 管数→ 2.5mmol/L蔗糖 乙酸缓冲液 H2O 葡萄糖2mmol/L 碱性铜试剂 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 / / 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 / / 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.7 1.0 0.8 / / / / / / / / / / / 0.2 1.0 / / / / / / / / / / / 由加酶开始计时 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 / / / 0 1 3 4 8 12 20 30 40 反应到时后立即向“2～12”管加入1ml碱性铜试剂中止反应 / 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 盖薄膜，扎孔，沸水浴上煮8min后速冷 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 蔗糖酶(~1:5) 反应时间min 碱性铜试剂 磷钼酸试剂 H2O 测定A650 生成还原糖的 ?moles数
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