反复倒转试管，混匀。用塑料比色杯测定时，空白对照管溶液必须充分摇匀，彻底除去气泡，测A510值时要检查参比杯内壁上是否有气泡，若有，须倒回原试管，再摇动除去残余气泡。
实验中不允许用嘴吸砷试剂。实验完毕后要注意洗手。
3. 第9、10二管是先加中止反应的Nelson's试剂，后加酶，以保证加酶后不再产生任何还原糖，用以校正蔗糖试剂本身的水解和酸水解。用第 9、10二管的数据画一直线，求出其他各管的校正数据，对所测各管的A510值进行校正，然后计算每管的[S]，1/[S]，V和1/V。
4. 画出反应速度V与底物浓度[S] 的关系图，（米氏曲线）和1/V~1/[S]双倒数关系图，（不要直接用A510值作图），计算Km和Vmax，并与文献值进行比较。
表 4 底物浓度对酶催化反应速度的影响（Km 和Vmax测定表）
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 管数→ 0.5mol/L/ 0.02 0.03 0.04 0.06 0.08 0.10 0.20 0.10 0.20 / / 蔗糖 H2O 0.6 0.58 0.57 0.56 0.54 0.52 0.50 0.40 0.50 0.40 1.0 0.8 乙酸 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 / / 缓冲液 Nelson’s / / / / / / / / 1.0 1.0 / / 试剂 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 / / *蔗糖酶 葡萄糖 / / / / / / / / / / / 0.2 4mmol/L 由加酶开始准确计时，反应10min。 Nelson’s 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 / / 1.0 1.0 试剂 盖薄膜，扎孔，沸水浴中煮20min后速冷 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 砷试剂 充分混合，除气泡，放置5min H2O 7.0 7.0 7.0 7.0 7.0 7.0 7.0 7.0 7.0 7.0 7.0 7.0 旋涡混合器上充分混合 A510 校正值 校正后 A510 ［S］ 1/［S］ V 1/V *：表4中酶的稀释倍数需仔细试测，使第2管的A510值达到0.2~0.3，以便能同时适用于下面的脲抑制实验。
催化反应速度的计算：
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V?A510(校正)?0.2?4A'510?10?2
V : 每ml反应液，每min消耗掉的蔗糖底物的μmol数 A’510 : 第12管的吸光度值，以11管为参比 0.2×4 : 4μmol/ml 葡萄糖取0.2ml 10 : 反应10min
2 : 每μmol蔗糖水解成2μmol还原糖
（八）尿素（脲）抑制蔗糖酶的实验
抑制剂与酶的活性部位结合，改变了酶活性部位的结构或性质，引起酶活力下降。根据抑制剂与酶给合的特点可分为可逆与不可逆抑制剂。可逆抑制剂与酶是通过共价健结合，不能用透析等物理方法解除。这二种抑制剂类型可以通过实验进行判断。实验方法为：在固定抑制浓度的情况下，用一系列不同浓度的酶与抑制剂结合，并测定反应速度。以反应速度对酶浓度作图，根据曲线的特征即可判断之。如下图所示：
在可逆抑制类型中可分为竞争性抑制，非竞争性抑制和反竞争性抑制三种： 1. 竞争性抑制：
在竞争性抑制中，酶既可以与底物结合，又可以与抑制剂结合，但却不能与二者同时结合，即有ES和EI，而不存在ESI。其动力学特征是表观值Km'增加，而最大反应速度Vmax 不变，公式为：
VI?VKm(1?238
max[S])?[S}[I]KI表观米氏常数Km’为：
K'm?Km(1?[I]KI)
已知抑制剂浓度 [I] ，由斜率计算出抑制剂常数KI，即可算出表观米氏常数Km’。
2. 非竞争性抑制：
在非竞争性抑制中，酶可以与底物和抑制剂同时结合，形成EIS，但EIS不能进一步转变为产物。其动力学特征是Vmax 降低而Km不变，公式为：
VI?(1?
V[I]KImax[S])(Km?[S])239
表观最大反应速度Vmax’为：
V'max?V1?max[I]KI
已知 [I] ，由斜率计算出KI，即可计算出表观Vmax’。 实验方法：
1. 判断可逆与不可逆抑制的实验可选做。
2. 不含抑制剂（脲）的实验，可用实验（七）的数据，但必须是用同一稀释倍数的酶，也可以重做，注意酶浓度要大些。 3. 含脲抑制剂的实验可参照“表4”设计实验方案。共做三种抑制剂浓度 [I] 的实验，即分别为加4mol/L的脲0.10ml 、0.20ml 和0.30ml，（注意：此时要分别少加H2O 0.1ml 、0.2ml和 0.3ml），仍为12支试管，每支试管都要加脲，第9、10两管仍为校正酸水解。第11、12标准管也要加脲，以消除脲对显色的影响。
4. 画出反应速度与底物浓度的关系图，和I/V~I/[S]关系图，计算Km、Vmax 、KI和相应的表观值，讨论脲对蔗糖酶活性的影响。
（九）棉子糖和果糖抑制蔗糖酶的实验
棉子糖是一种非还原性三糖，与蔗糖有相似的结构：
蔗糖酶水解棉子糖，可得到双糖（密二糖）和单糖（果糖），果糖是还原糖。棉子糖水解的速度可以用所生成的还原糖来进行测定，由于本实验是要测定棉子糖和果糖对蔗糖酶水解蔗糖的抑制作用，为了排除果糖的干扰，就要选用一种专一地特异性测定葡萄糖的方法，本实验采用葡萄糖氧化酶法来测定反应中生成的葡萄糖。这一方法的反应如下：
葡萄糖氧化酶
Glucose + H2O H2O2 + Gluconic acid Glucose Oxidase
过氧化物酶
+
H2O2 + o－Dianiside + H H2O + Yellow pigment (Reduced dye) Peroxidase (Oxidized dye) 邻联茴香胺 黄色色素
反应生成的黄色色素与葡萄糖含量成正比，用分光光度法测定420nm的吸光度值A420。
葡萄糖氧化酶试剂的配制方法为：
溶液A：40mg辣根过氧化物酶（存于冰冻格）溶于1000ml 0.1mol/L pH7.0的磷酸钠缓冲液，加1500单位葡萄糖氧化酶（每组学生150ml）（当日新鲜配制）（教师配）
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溶液B：溶解0.66g o－DianisidediHCl邻联茴香胺染料于100ml H2O中(先用少量冰乙酸溶解后再加H2O)，置于棕色瓶冷藏。不可接触皮肤，是致癌物（教师配）。 使用时取“溶液A”100ml加“溶液B”1ml。（称G－O试剂）
表5 葡萄糖氧化酶法测定葡萄糖的标准曲线 1 2 3 4 5 6 7 / 0.05 0.10 0.20 0.30 0.50 0.60 葡萄糖(2mmol/L) 1.0 0.95 0.90 0.80 0.70 0.50 0.40 H2O 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 G－O试剂 混合，室温下每管准确反应15min 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 4N HCl 混合，至少放置5min A420 葡萄糖?moles数
表 6 抑制剂（棉子糖与果糖）对酶活性的影响 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 (空白) (校 正) / 0.02 0.04 0.06 0.10 0.13 0.15 0.20 0.10 0.20 0.5mol/L蔗糖 0.7 0.68 0.66 0.64 0.60 0.57 0.55 0.50 0.70 0.60 H2O 0.2 乙酸缓冲液 0.1 / / *蔗糖酶 室温下准确反应10min，立即放入沸水浴加热2min以中 止反应，再立即放入冰浴速冷。 4.0 G－O试剂 混合均匀，室温下准确反应15min。 0.1 4N HCl 混合均匀，室温放置5min。 A420 *：试测酶浓度时，0.1ml酶溶液应使第8管得到1.0左右的吸光度。
实验方法：
1. 测定葡萄糖的标准曲线
准备7支试管按上面“表5 ”中的步骤进行测定，用A420和葡萄糖的?moles数作图。
2. 棉子糖和果糖抑制作用的测定
（1）准备26支试管，试管1～10用上面“表6”所列的方法进行测定，第1管作空白对照，第9、10两管用作校正蔗糖的水解。
（2）试管11～18放入1～8管同样量的缓冲液和蔗糖，但还要加0.5ml 0.5mmol/L的棉子糖，然后用H2O补加到0.9ml，加0.1ml同样的酶溶液开始计时，详见“表6”，第11管为这一组的空白对照。
（3）试管19～26进行同样的操作，只是用0.5mol/L果糖代替棉子糖。
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