（五）pH对蔗糖酶活动性的影响
酶的生物学特性之一是它对酸碱度的敏感性，这表现在酶的活性和稳定性易受环境pH的影响。
pH对酶的活性的影响极为显著，通常各种酶只在一定的pH范围内才表现出活性，同一种酶在不同的pH值下所表现的活性不同，其表现活性最高时的pH值称为酶的最适pH。各种酶在特定条件下都有它各自的最适pH。在进行酶学研究时一般都要制作一条pH与酶活性的关系曲线，即保持其它条件恒定，在不同pH条件下测定酶促反应速度，以pH值为横座标，反应速度为纵座标作图。由此曲线，不仅可以了解反应速度随pH值变化的情况，而且可以求得酶的最适PH。
酶溶液pH值之所以会影响酶的活性，很可能是因为它改变了酶活性部位有关基团的解离状态，而酶只有处于一种特殊的解离形式时才具有活性，例如：
＋ ＋
HH
EH2＋ ＋ EH E－ pKa1 (有活性) pKa2
酶的活性部位有关基团的解离形式如果发生变化，都将使酶转入“无活性”状态。在最适pH时，酶分子上活性基团的解离状态最适合于酶与底物的作用。此外，缓冲系统的离子性质和离子强度也会对酶的催化反应产生影响。
蔗糖酶有两组离子化活性基团，它们均影响酶水解蔗糖的能力。其解离常数分别是 pKa = 7和pKa =3 。
实验方法：
1. 按下表配制12种缓冲溶液（公用）：
将两种缓冲试剂混合后总体积均为10ml，其溶液pH值以酸度计测量值为准。 溶液pH 缓冲试剂 体积ml 缓冲试剂 体积ml 2.5 8.00 0.2mol/L磷酸氢二钠 2.00 0.2mol/L柠檬酸 3.0 6.35 0.2mol/L磷酸氢二钠 3.65 0.2mol/L柠檬酸 3.5 5.15 0.2mol/L磷酸氢二钠 4.85 0.2mol/L柠檬酸 3.5 0.60 0.2mol/L乙酸 9.40 0.2mol/L乙酸钠 4.0 1.80 0.2mol/L乙酸 8.20 0.2mol/L乙酸钠 4.5 4.30 0.2mol/L乙酸 5.70 0.2mol/L乙酸钠 5.0 7.00 0.2mol/L乙酸 3.00 0.2mol/L乙酸钠 5.5 8.80 0.2mol/L乙酸 1.20 0.2mol/L乙酸钠 6.0 9.50 0.2mol/L乙酸 0.50 0.2mol/L乙酸钠 6.0 8.77 0.2mol/L磷酸氢二钠 1.23 0.2mol/L磷酸二氢钠 6.5 6.85 0.2mol/L磷酸氢二钠 3.15 0.2mol/L磷酸二氢钠 7.0 3.90 0.2mol/L磷酸氢二钠 6.10 0.2mol/L磷酸二氢钠 232
2. 准备二组各12支试管，第一组12支试管每支都加入0.2ml上表中相应的缓冲液，然后加入一定量的蔗糖酶（此时的蔗糖酶只能用H2O稀释，酶的稀释倍数和加入量要选择适当，以便在当时的实验条件下能得到0.6~1.0的光吸收值（A650））。另一组12支试管也是每支都加入0.2ml上表中相应的缓冲液，但不再加酶而加入等量的去离子水，分别作为测定时的空白对照管。所有的试管都用水补足到0.8ml。
3. 所有的试管按一定时间间隔加入0.2ml蔗糖（0.2mol/L)开始反应，反应10min后分别加入1.0ml碱性铜试剂，用保鲜膜包住试管口并剌一小孔，在沸水浴中煮8分钟，取出速冷，分别加入1.0ml磷钼酸试剂，反应完毕后加入5.0ml水，摇匀测定A650。 4. 本实验再准备二支试管，一支用水作空白对照；另一支作葡萄糖标准管。 5. 画出不同pH下蔗糖酶活性（?moles/min）与pH的关系曲线，注意画出pH值相同，而离子不同的两点，观察不同离子对酶活性的影响。
（六）温度对酶活性的影响和反应活化能的测定
对温度的敏感性是酶的又一个重要特性。温度对酶的作用具有双重影响，一方面温度升高会加速酶反应速度；另一方面又会加速酶蛋白的变性速度，因此，在较低的温度范围内，酶反应速度随温度升高而增大，但是超过一定温度后，反应速度反而下降。酶反应速度达到最大时的温度称为酶反应的最适温度。如果保持其它反应条件恒定，在一系列不同的温度下测定酶活力，即可得到温度～酶活性曲线，并得到酶反应的最适温度。最适温度不是一个恒定的数值，它与反应条件有关。例如反应时间延长，最适温度将降低。大多数酶在60℃以上变性失活，个别的酶可以耐100℃左右的高温。本实验除了测定蔗糖酶催化蔗糖水解反应的热稳定温度范围与最适温度外，还可以同时测定反应的活化能。活化能越低，反应速度就越快。酶作为催化剂可以大大降低反应的活化能，从而大大增加反应的速度。本实验除了测定蔗糖酶催化反应的活化能外，还要测定酸催化这一反应的活化能，后者比前者要大的多，说明酸催化的能力远不及蔗糖酶。
活化能可用阿累尼乌斯方程式计算：
lnk??EaR?1T?A
式中： Ea为话化能（Cal/mole），k为反应速度常数（?moles/min），R为气体常数（1.987Cal/deg﹒mole），T为绝对温度（℃+273），A为常数。 本实验中的速度常数“k”，可以直接用所测定的吸光度值或反应速度v代替，进行作图和计算，请对此进行推导和论证（提示：蔗糖酶催化蔗糖底物水解的反应是一级反应）。 实验方法：
本实验要测定0℃～100℃，之间16个不同温度下蔗糖酶催化和酸催化的反应速度。
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这16个温度是冰水浴的0℃，室温（约20℃），沸水浴的100℃和13个水浴温度：10℃、30℃、40℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、
95℃。
每个温度准备2支试管，一支加酶，测酶催化，1支不加，以乙酸缓冲液作为酸，测酸催化。
1. 确定酶的稀释倍数，试管中加入0.2ml 0.2mol/L pH4.9的乙酸缓冲液，0.2ml稀释的酶，加水至0.8ml 加入0.2ml 0.2mol/L的蔗糖开始计时，在室温下反应10min，仍用费林试剂法进行测定，须得到0.2～0.3A的吸光度，准备一个水的空白对照管（0.8ml去离子水加0.2ml 0.2mol/L的蔗糖），用于测定所有的样品管。
2. 测定上列各个温度下的反应速度，每次用2支试管，均加入0.2ml乙酸缓冲液，一支加0.2ml酶，另一支不加酶，均用水调至0.8ml，放入水浴温度下使反应物平衡30秒，加入0.2mol/L蔗糖0.2ml，准确反应10分钟，立即加入1.0ml碱性铜试剂中止反应，按规定进行操作，测定各管A650值，记录每个水浴的准确温度。
3. 酶催化的各管A650 值均进行酸催化的校正。用分别画出酶催化和酸催化的反应速度对温度的关系曲线和lnk～1/T的关系曲线，用二条lnk～1/T关系曲线的线性部分计算两种活化能。
（文献值：蔗糖酶催化蔗糖水解的活化能为：Ea=8000Cal/mole 酸催化蔗糖水解的活化能为：Ea=25000Cal/mole）
4. 计算温度系数Q10，即温度每升高10℃，反应速度提高的倍数：
V(T?10)Q10?VT≌k(T?10)kT
请推导计算公式：
lnQ10?10?EaR?T?(T?10)
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（七）底物浓度对催化反应速度的影响及来米氏常数Km和最大反应速度Vmax的测定
根据Michaelis-Menten 方程：
V?Vmax［S］Km?［S］
可以得到Lineweaver-Burk双倒数值线方程：
1V?KmVmax11??［S］Vmax
在 1/V 纵轴上的截距是1/Vmax ，在1/［S］横轴上的截距是－1/Km。
测定Km 和Vmax，特别是测定Km，是酶学研究的基本内容之一，Km是酶的一个基本的特性常数，它包含着酶与底物结合和解离的性质，特别是同一种酶能够作用于几种不同的底物时，米氏常数Km往往可以反映出酶与各种底物的亲和力强弱，Km值越大，说明酶与底物的亲和力越弱，反之，Km值越小，酶与底物的亲和力越强。
双倒数作图法应用最广泛，其优点是：① 可以精确地测定Km 和Vmax；② 根据是否偏离线性很容易看出反应是否违反Michaelis-Menten动力学；③ 可以较容易地分析各种抑制剂的影响。此作法的缺点是实验点不均匀，V小时误差很大。为此，建议采用一种新的Eisenthal直线作图法，即将Michaelis-Menten方程改变为：
V?V?Km［S］Vmax
作图时，在纵轴和横轴上截取每对实验值：V1～［S］1；V2～［S］2；V3～［S］3； ——连接诸二截点，得多条直线相交于一点，由此点即可得Km和Vmax。
此作图法的优点是：① 不用作双倒数计算；② 很容易识别出那些不正确的测定结果。
还可以用Hanes方程进行作图，斜率是1/Vmax，截距分别是－Km和Km/Vmax :
［S］Km1??［S］VVmaxVmax 实验方法：
1. 本实验和下一个实验均采用 Nelson's法分析反应产物还原糖，Nelson's法的试剂配
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制见本实验最后第 页的“试剂配制方法”。因为使用了剧毒药品，操作必须十分仔细小心！为了掌握Nelson's法测定的范围，可先作一条标准曲线。按下面的“表３”进行实验操作：
Eisenthal直线作图法：
表 ３ Nelson’s法测定葡萄糖的标准曲线 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 葡萄糖(4mmol/L) / 0.02 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 / / / / / / / / / / 0.20 / 果糖(4mmol/L) / / / / / / / / / 0.20 蔗糖(4mmol/L) 1.0 0.98 0.95 0.90 0.85 0.80 0.75 0.70 0.80 0.80 H2O 1.0 Nelson’s试剂 盖薄膜，扎孔，沸水浴中煮20min后速冷 1.0 砷试剂 充分混合，除气泡，放置5min 7.0 H2O 旋涡混合器上充分混合 每管中糖的 ?moles数 A510
用第1管作空白对照，测定其余各管 510nm 的吸光度A510。用A510值对还原糖的?mole数作图。
2. 按下面的“表4”测定不同底物浓度对催化速度的影响。（表4见下页）
为使Km测准，必须先加蔗糖，精确移液，准确计时，每隔30秒钟 或1分钟加酶一次，加酶后要摇动一下试管，每支试管都要保证准确反应10分钟，然后加1.0ml Nelson's试剂，立即用保鲜膜盖住管口，绕上橡皮筋，用针剌一小孔，几根试管用一根橡皮筋套住放入沸水浴，煮20分钟后取出放入冷水中速冷。加砷试剂时移液管身不要接触试管壁。最后加7.0ml H2O以后，要充分摇匀，必要时可用一小块保鲜膜盖住管口，
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