鲁东大学生命科学学院 2010 生物技术专业《生物技术综合实验》实验指导
得到所需微生物的过程。菌株分离、筛选（screening）虽为两个环节，但却不能绝然分开，因为分离中的一些措施本身就具有筛选作用。工业微生物产生菌的筛选一般包括两大部分：一是从自然界分离所需要的菌株，二是把分离到的野生型菌株进一步纯化并进行代谢产物鉴别。
枯草芽孢杆菌在自然界中分布很广，常用来生产α-淀粉酶，在含淀粉质较多的环境中经常能够找到。由于其体内能够产生芽孢，能抗高热，所以，获得样品时可先加热，将其他非耐热的微生物杀死得以富集。
透明圈法是常见的初筛方法。在含有淀粉的平板上，由于枯草杆菌能够产生淀粉酶，因此，可将菌落周围的淀粉酶解掉，形成透明圈。所以，我们可以根据是否产生透明圈，来初筛目的菌。 三、实验材料
1. 培养基：筛选培养基。
2. 试剂：芽孢染色液、碘-碘化钾溶液。
3. 其他器具：超净工作台、显微镜、培养皿、水浴锅；涂布棒、三角瓶、接种环、酒精灯等。 四、操作步骤
1．样品稀释：称取土样1g，加入到备好的玻璃珠和无菌水的三角瓶内，振摇5 min。根据微生物稀释方法操作，稀释到10－3～10－6。
2．加热处理：将最后三支土样稀释液，置于100℃沸水浴3～5 min，灭活营养细胞，保留芽孢。
3．涂布平板和培养：筛选培养基倒平板，凝固后，处理好的三个稀释度的样品各取0.1ml涂布平板，30℃倒置培养。 五、思考题
你认为还有哪些方法对样品进行预先处理，有益于本试验目标菌株的获得？
实验三、α-淀粉酶产生菌的分离与筛选
一、实验目的
学习从初筛菌株中进行目标菌株的挑选以及复筛的方法技术，掌握透明圈法、变色圈
6
鲁东大学生命科学学院 2010 生物技术专业《生物技术综合实验》实验指导
法进行产α-淀粉酶产生菌的复筛的技术。 二、实验原理
分离培养基是根据目的微生物特殊的生理特性或利用某些代谢产物生化反应来设计的。通过观察微生物在选择性培养基上生长状况或生化反应进行分离，可显著提高菌株分离纯化的效率。
在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培养基混浊。能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈，圈的大小初步反应该菌株利用底物的能力。该法在分离水解酶产生菌时采用较多，如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、核酸酶产生菌都会在含有底物的选择性培养基平板上形成肉眼可见的透明圈。在分离淀粉酶产生菌时，培养基以淀粉为唯一碳源，待样品涂布到平板上，经过培养形成单个菌落后，再用碘液进行鉴别，根据菌落周围是否出现透明圈来分离淀粉酶产生菌。透明圈与菌落直径的比例，可以反映菌株产酶能力的大小。 三、实验材料 1. 碘液制备
原碘液：称取分析纯结晶碘ll g，分析纯碘化钾22 g，注意：碘不好溶解，需要用研钵捣碎，最后达到完全溶解为之，定容至500mL，贮于棕色瓶内。
稀碘液：取原碘液2 mL，加碘化钾20 g，加蒸馏水溶解定容至500 mL ,贮于棕色瓶内。
四、操作步骤
1．单菌落挑取：
对平板上生长的单菌落进行编号，挑单菌落接种试管斜面保存（编号），并分别接种在同样平板培养基上，每个培养皿接不同的菌落4株（编号和标记）。置30℃培养箱培养。
2．初筛平板定性观察：
初筛平板浇上一层碘液，10分钟后观察，凡有无色透明圈即可看出它有淀粉酶产生。记录有淀粉酶产生的菌种号。
3．复筛平板的定性观察和定量测定：
培养二天后，浇上一层碘液，10分钟后观察，凡有无色透明圈即可看出它有淀粉酶产生。测量菌落直径与透明圈直径大小，计算透明圈直径/菌落直径的比值，挑取透明圈与菌落直径比大的菌株，用于做进一步的摇瓶筛选。 五、结果与讨论
提出一个你自己的更加高效、合理的菌株复筛方案。
7
鲁东大学生命科学学院 2010 生物技术专业《生物技术综合实验》实验指导
综合项目二、酵母菌的诱变育种
实验四、培养基配制和菌种活化
一、实验目的
学习制作适合于诱变处理的细胞的制备。 二、实验原理
通过人工方法可以使微生物发生突变，其突变率远远高于自发突变。再经过筛选和选育，可以简便、快速地筛选出不同类型的突变株，供生产和研究之用。人工诱变的突变是不定向的，但选择可以是定向的。
用来诱发突变的菌株称为出发菌株。出发菌株可以是自然界中分离出来的野生菌株，可以是生产中应用的自发突变菌株，也可以是已经诱发过的菌株。
诱变处理时应选择菌体生长的敏感期，如菌体的对数期，孢子或芽孢的萌发前期。选择孢子、芽孢，因其多为单核状态。一般制成单孢子或单细胞悬液，目的是能均匀接触诱变剂，并能减少诱变后件状的分离及退化现象。 三、实验材料
1.菌株：酒精酵母 2.CM培养基：
葡萄糖 40g MgSO4 2g 蛋白胨 10g 琼脂 15g 酵母膏 5g 水 1000ml KH2PO4 5g
不加琼脂即为液体CM，分装20ml于250ml三角瓶中。 3.TTC上层培养基
葡萄糖 5g TTC（红氮四唑） 0.5 g 琼脂 10g 水 1000ml 分装，58.84kPa灭菌 15min。 4.TTC下层培养基
葡萄糖 10g MgSO4 ?7H2O 0.4g 蛋白胨 2 g 琼脂 20 g
8
鲁东大学生命科学学院 2010 生物技术专业《生物技术综合实验》实验指导
酵母膏 5 g 水 1000 ml KH2PO4 1 g pH 5.5～5.7 5.MM甘培养基
酵母膏 6.7 g 甘油 20 ml 水 980 ml pH 5.5 琼脂粉 20 g 分装，58.84kPa灭菌 10min。
6．培养皿、涂布棒、稀释试管若干，1ml移液管（棉封）若干，牙签若干，包扎后灭菌备用。
7.恒温震荡器、培养箱 四、操作步骤
1. 菌种活化：保存菌种转接CM培养基斜面，30℃培养活化2天。
2. 培养基制备及其它材料的准备：按照要求准备各种实验用培养基，灭菌后备用。 3. 其它材料按要求准备：按照要求准备其它玻璃器皿，灭菌备用。 五、结果与讨论
讨论酵母细胞诱变处理的敏感期可以选择哪个阶段？
试验五、酵母菌的诱变处理
一、 实验目的
学习和掌握微生物的诱变处理方法。 二、实验原理
不同诱变剂诱变的作用强弱不同。微生物诱变剂常用紫外线、硫酸乙二脂、烷化剂等。诱变剂选择的原则是使用的方便性和有效性，获得高正变株出现率的就是有效诱变剂。诱变剂多为致癌剂，操作时要注意安全。
诱变剂剂量选择及处理时间一般以杀菌率控制。目前常采用剂量是杀菌率为30（70）—80%，杀菌率取决于剂量和作用时间及作用距离。用高剂量诱变剂处理获得的负突变率高，而在低的剂量中正突变率反而较高。
9
鲁东大学生命科学学院 2010 生物技术专业《生物技术综合实验》实验指导
三、实验材料 1.溴化乙锭 2.TTC（红氮四唑） 四、操作步骤
1．将准备好的CM固体培养基溶化后倒平皿，过夜，（检验是否无菌，干燥）。 2．取活化后的酵母菌1环，接入到三角瓶中液体CM培养基中，并加入诱变剂溴化乙锭10μg/ml，120rpm 、30℃震荡培养过夜，进行诱变处理。 五、结果与讨论
简述溴化乙锭的诱变作用机理。
试验六、呼吸缺陷型菌株的初筛
一、 实验目的
学习和掌握呼吸缺陷型菌株的初筛方法。 二、实验原理
许多突变株在菌落形态上会发生变异，所以通过观察菌落形态特征挑出突变株是进行初筛的有效手段之一。
在酵母中，呼吸缺陷型突变株是经常遇到的。在平皿培养后，一般为小菌落，这些小菌落丧失呼吸能力。产生这种变异的原因， 主要是细胞质基因发生突变，但有时核基因也会突变。小菌落突变后，对非发酵型底物如甘油、酒精、醋酸等不能氧化，但CO2放出高于对照株，酒精脱氢酶活力也较对照高出1倍左右，对提高酒精产率有好处。同样，呼吸缺陷型也是育种工作可利用的一个有效的遗传标记。 三、实验材料
1．TTC下层培养基 2．TTC上层培养基 3．灭菌的培养皿 四、操作步骤
1．将诱变处理过的酵母培养液适当稀释（稀释度初步10-3、10-4、10-5），涂布CM培养基平板，涂布后30℃培养24h。
10