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2．TTC下层培养基倒平板。
3．将CM培养基平板上长出的菌落点种 TTC下层平板上，30℃培养3d。
4. 培养3天后，将TTC上层培养基溶化并冷却（不烫手）后，小心倾入TTC上层培养基上，使其刚好掩埋菌落。等凝固后，30℃培养2～3h。此时，平板菌落颜色会区分成红色、粉红色和白色。呼吸缺陷型突变株为白色菌落。 五、结果与讨论
讨论呼吸缺陷型突变株为白色菌落为白色，其它菌株红色、粉红色的机理。
试验七、呼吸缺陷型酵母菌的验证
一、 实验目的
学习和掌握呼吸缺陷型验证方法。 二、实验原理
呼吸缺陷型酵母突变株对非发酵型底物如甘油、酒精、醋酸等不能氧化，因此不能在以甘油为唯一碳源的培养基上生长，利用这一特性可以进行呼吸缺陷型突变株的验证。 三、实验材料 1.CM培养基 2．MM甘培养基 3．灭菌的培养皿 4．无菌牙签。 四、操作步骤
1． 用无菌牙签将在TTC鉴别培养基上生长的白色小菌落分别点种到MM甘培养基和CM培养基上。注意点种时，先点MM甘培养基，后点种CM培养基，并在平皿上做好标记。30℃培养1d。
2． 观察记录MM甘培养基和CM培养基上菌落的生长状况，验证白色的小菌落是否是呼吸缺陷型突变株。 五、结果与讨论
如果白色小菌落分别点种到MM甘培养基和CM培养基上培养后都有生长，讨论有哪些原因？
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综合项目三、谷氨酸发酵及提取工艺
实验八、谷氨酸菌种的制备
一、
实验目的：
了解发酵工业菌种的制备工艺流程和质量控制方法，并为本发酵实验准备菌种。 二、
实验原理：
谷氨酸棒杆菌是一种好氧性细菌，在合适的培养基上经摇瓶培养能快速生长，可得到大量健壮的种子。处于旺盛生长的生长对数期的菌体适合作为种子。 三、
实验器材和药品：
试管、三角瓶、抽滤瓶、高压灭菌锅、摇床、培养箱、显微镜等。 四、
实验步骤：
1.斜面种子的制备
①将试管洗净，做好棉塞，并7支一组捆扎好，空消：0.10MPa，30min。
②按配方配制斜面培养基，加热将培养基溶解后分装到已消好的空试管中，装量约为1/5，灭菌后并摆成斜面。
③将做好的斜面37℃空培24h，检查确定无菌后备用。
④将保存的斜面菌种上的菌苔划线接种到新制斜面上，37℃培养24h，制成斜面菌种。 斜面培养基配方： 葡萄糖0.1% 蛋白胨1% 牛肉膏1.0% 氯化钠0.5% 琼脂2.0% pH值7.0
灭菌条件：0.1MPa，30min 2.一级种子培养
培养基配方： 葡萄糖 ：2.5% 尿素：0.5% 硫酸镁：0.04% 磷酸氢二钾：0.1% 玉米浆粉：0.5~0.6% 硫酸亚铁：2mg/L
硫酸锰：2mg/L pH 7.0
在500mL三角瓶中装入50mL培养基，8层纱布封口，0.10MPa表压灭菌30min，冷却后接种，接种量为一支斜面接一瓶。置旋转摇床上培养12h（转速170~190 r/min），培养温度30~32℃。
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3.二级种子培养 培养基配方：
葡萄糖 ：2.5% 尿素：0.34% 硫酸镁：0.04% 磷酸氢二钾：0.16%
玉米浆粉：0.5~0.6% 消泡剂：0.086ml/L pH 7.0
0.08MPa表压，30min灭菌，冷却接种后，摇床7~8h。二级种子的制备量按发酵罐投料量的10%的量准备。 五、思考题
种子制备过程中应注意哪些事项？
实验九、谷氨酸的中糖发酵及控制
一、 实验目的
了解发酵罐的操作程序和注意事项，完成谷氨酸发酵的全过程操作。 二、 实验原理
谷氨酸的生物合成包括EMP、HMP、TCA、乙醛酸循环、二氧化碳的固定反应等。谷氨酸产生菌丧失或仅有微弱的α-酮戊二酸脱氢酶活力，但谷氨酸脱氢酶活性很强，同时NADPH2再氧化能力弱，这样使α-酮戊二酸到琥珀酸的过程受阻，在有NH4+存在时，经过谷氨酸脱氢酶作用和还原氨基化反应生成谷氨酸。 三、 实验装置
发酵罐系统（发酵罐，蒸汽发生器，空压机）、恒温培养箱、分光光度计等。 四、 实验步骤 1. 投料
投料量：按发酵罐体积的70%配料。
配方： 葡萄糖： 160g/L 尿素 5 g/L 硫酸镁： 0.5 g/L 磷酸氢二钾： 1.5 g/L
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玉米浆 25~35 g/L 硫酸亚铁 20mg/L 硫酸锰 20mg/L
pH 7.0 2. 实消
注意罐压，控制0.1~0.11MPa，15min，通过蒸汽流量调节。 3. 接种
接种量为10%，通过接种管接种。 4. 发酵过程控制
（1） 温度控制：谷氨酸发酵前期为菌体生长期，最适温度30~32℃，后期为谷氨
酸产生期，产酸期温度控制在34~36℃。
（2） pH控制：发酵过程中产物的积累会导致pH下降，而流加氮源（氨水、尿
素）会导致pH升高。发酵中当pH降到7.0~7.1时，应及时流加氮源。菌体生长期（0~12h）控制pH不大于8.2（由尿素流加量、风量和搅拌转速来调节）；产酸期（12h以后）控制pH 7.1~7.2。 （3） 发酵过程中参数的记录和分析：
pH 2小时1次 pH计
还原糖 3小时1次 斐林试剂滴定法 谷氨酸 3小时1次
附录方法
菌体生长量 2小时1次 752分光光度计OD620nm 温度 2小时1次 温度计 风量 2小时1次 气体流量计
5. 放罐
残糖5g/L以下，耗糖速率缓慢时放罐。 四、实验结果与讨论
以时间为横坐标，OD620nm、残糖量、谷氨酸量为纵坐标，绘制发酵过程中参数变化曲线。
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实验十、发酵液中谷氨酸的回收及精制
一、 实验目的
1. 了解用等电点法从发酵液中回收谷氨酸的方法。 2. 掌握由谷氨酸制备谷氨酸钠的方法。
3. 掌握脱色、浓缩、结晶等单元操作的原理和方法。 二、 实验原理
谷氨酸的分离提纯，通常应用它的两性电解质的性质。通过谷氨酸的溶解度、分子大小、吸附剂的作用以及谷氨酸的成盐作用等，可以把发酵液中的谷氨酸提取分离出来。 三、 实验器材
无极速搅拌机、旋转蒸发器、恒温水浴锅、水环式真空泵、pH试纸、盐酸。 四、 实验步骤 （一） 等电点回收 1. 流程
发酵液——离心除菌体（5000rpm, 10min）——加盐酸——育晶2h（pH 4~5）——加盐酸——育晶2h（pH3.5~3.8）——加盐酸——育晶2h（pH 3.0~3.2）——加盐酸——搅拌育晶20h——沉淀4h——母液和细谷氨酸。 2. 等电点操作
（1） 先测定发酵液的体积、pH、谷氨酸含量和温度。若放罐的发酵液温度高，应先将发
酵液的温度冷却到25~30℃，消除泡沫后再开始调pH，用盐酸调到pH 5.0。 （2） 当pH达到4.5时，应放慢加酸速度，注意观察晶核形成情况，若有晶核形成，应停
止加酸，搅拌，育晶2~4h。若发酵不正常，产酸低于4%，pH调到3.5~3.8左右。 （3） 搅拌2h，以利于晶核的形成，或者适当加一点晶种刺激起晶。
（4） 搅拌，育晶2h后，继续加酸，耗时4~6h，调pH至3.0~3.2，搅拌2h后开大冷却水
降温，使温度尽可能降低。
（5） 到等电点pH（3.2）后，继续搅拌16h以上，停止搅拌静置沉淀4h，关闭冷却水，
吸去上层菌液，底部谷氨酸离心甩干。 （二） 谷氨酸钠的精制
回收的谷氨酸又称麸酸，并没有鲜味，用碳酸钠中和精制，在pH7.0左右得到谷氨酸一钠，在pH 9~10左右得到谷氨酸二钠。
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