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(2) 孢子悬液的制备：在一级种子斜面菌种管中加入10mL无菌水，用接种环搅起黑曲霉孢子，在振荡器上振荡两分钟制成均匀的孢子悬液。
(3) 二级种曲的制备：吸取孢子悬液1mL于装有种子培养基的三角瓶中，然后摊开纱布，扎好，并在掌心轻拍三角瓶，使孢子培养基充分混合，于28℃恒温培养箱中培养1天后，再次拍匀三角瓶内培养物，继续培养3～4天即成种曲。 2、 发酵培养
(1) 接种与摊盘：将灭菌的发酵培养基倒入灭菌的搪瓷盘中，厚度约1-2cm，待培养基冷却到30℃左右时均匀拌入1%的种曲，在培养基上覆盖两层灭菌纱布。 (2) 发酵培养：摊盘之后，将搪瓷盘放在恒温培养箱中，并在培养箱中放置一个盛有清水的小搪瓷盘，以维持培养箱中的湿度，30℃培养24h后翻曲一次，并将培养箱的温度调整至28℃，继续发酵4~5天。 3、 柠檬酸提取
发酵结束后，将培养物倒入一个大烧杯中，加入蒸馏水，加水比1：3，搅匀，浸泡1h,用两层纱布过滤。将滤液加热到100℃处理10min，离心（3000r/min,10min）以除去蛋白质、酶、菌体、孢子等其他杂质。向清液中加碳酸钙进行中和(每100g柠檬酸加入71.4kg碳酸钙，一定要控制好终点，过量的碳酸钙会造成胶体等其他杂质的沉淀而影响质量)。继续加热至90℃，反应30min，中和终点用NaOH滴定，此时柠檬酸以钙盐的方式析出。 4、 酸化
将柠檬酸钙加水搅成糊状，在不断搅拌下将硫酸缓慢加入，用量为碳酸钙的85%-90%，酸解的温度应控制在80℃以上。当加入足量的硫酸时，柠檬酸就游离出来。3000r/min离心10min收集上清。 5、 脱色和离子交换
用活性炭进行脱色，用阳离子树脂去除各种阳离子，当流出液pH 为4.0时，表示有柠檬酸流出，开始收集。 6、 总酸量测定
精确吸取所收集的上清液1mL，加2-3滴酚酞试剂，用0.1M 的NaOH溶液 进行滴定至微红色，计算用去的NaOH的毫升数，计算柠檬酸的百分含量。 7、柠檬酸的测定：（参见附录七） 8、 纸层析鉴定
(1) 点样：在距新华滤纸底端2.5公分处划一道横线，用毛细管将2%的标准柠檬酸溶
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液和上清液点在滤纸的横线上，每个样品间距2公分。
(2) 层析：将点好样的滤纸做成圆筒状，置于含有展开剂的层析缸中，于20~25℃条件上行扩展20-25cm后取出，用吹风机吹干溶剂。 (3) 显色：层析滤纸用溴甲酚绿乙醇喷雾显色。
设计项目三、α-淀粉酶生产
一、实验原理
α-淀粉酶是我国目前用途最广泛、产量最大的工业酶制剂种类之一，在酶制剂生产中占有重要地位，应用领域主要集中在淀粉加工业、纸浆制造、纺织工业、酿造酒精及饲料加工业等。国内主要采用解淀粉芽孢杆菌BF7658及其变异菌株，以液体深层发酵法(Submerged fermentation, SmF)生产中温α-淀粉酶，也有许多厂家生产高温α-淀粉酶，但高温α-淀粉酶毕竟不能完全代替中温α-淀粉酶，许多场合由于工艺等原因必须采用中温α-淀粉酶。
利用固态发酵法(Solid-state fermentation，SSF)生产α-淀粉酶具有生产效率高、工艺简单、操作粗放、能耗少、废液少、产物分离较容易等优点，因而与SmF法相比生产成本较低。
二、菌种与培养基
1．菌种
解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens 2．斜面培养基
牛肉膏10.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，NaC 15g/L，可溶性淀粉10.0 g/L，琼脂20.0 g/L，pH 6.5～7.0，0.1 MPa蒸汽灭菌20 min。
3．液体种子培养基
牛肉膏10.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，NaCl 5 g/L，可溶性淀粉5 g/L，pH 6.5～7.0，0.1 MPa蒸汽灭菌20 min。
4．三角瓶固体发酵培养基
250 mL的三角瓶中，加15 g麸皮和20 mL水，0.1 MPa灭菌30 min。 三、试验步骤
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1．培养条件
保藏菌种在斜面上活化一代(37 ℃培养24 h)，然后挑取一环接入种子培养基，37 ℃下于旋转式摇床200 r／min培养10 h，再按一定的接种量（0.5%）接入三角瓶固体发酵培养基，在37 ℃培养60 h。
2．酶活测定
按附录方法测定α-淀粉酶活力。 3．发酵产酶曲线的确定
分别在12、24、36、48、60、72、84hr取样分析，测定酶活力，以培养时间为横坐标，干曲酶活力（u/g）为纵坐标，做产酶标准曲线。
四、思考题
试比较固态发酵和液态发酵的优缺点。
设计项目四、酵母细胞的固定化
一、实验目的：
学习固定化的原理，了解固定化细胞在实际中的应用。 二、实验原理：
固定化酶和固定化细胞是利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术 , 包括包埋法、化学结合法 ( 将酶分子或细胞相互结合 , 或将其结合到载体上 ) 和物理吸附法。一般来说 , 酶更适合采用化学结合和物理吸附法固定化, 而细胞多采用包埋法固定化。这是因为细胞体积大, 而酶分子很小，体积大的细胞难以被吸附或结合, 而酶分子容易从包埋材料中漏出。
本实验采用包埋法固定化酵母活细胞, 即将酵母活细胞均匀地包埋在不溶于水的多孔性载体中。常用的载体有明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素和聚丙烯酰胺等。本实验选用海藻酸钠作为包埋材料。 三、试剂与材料： （1） 酿酒酵母 （2） 海藻酸钠 （3） 氯化钙
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（4） 玻璃棒、烧杯、三角瓶、温度计、吸管、培养箱等。 四、实验步骤
1．酵母细胞的活化：称取 lg 干酵母, 放入 50mL 的小烧杯中, 加入蒸馏水lOmL, 用玻璃棒搅拌, 使酵母细胞混合均匀, 成糊状, 放置 lh 左右, 使其活化。
2．配制浓度为 0.05mol/L 的 CaCl2 溶液： 称取无水 CaCl2 0.83g , 放入 200mL 的烧杯中, 加入150mL 的蒸馏水, 使其充分溶解, 待用。
3．配制海藻酸纳溶液： 称取 0.7g 海藻酸钠 , 放入 50 mL 小烧杯中 , 加入 10mL水 ,加热, 边加热边搅拌, 将海藻酸钠调成糊状, 直至完全溶化, 用蒸馏水定容至10mL。注意：加热时要用小火, 或者间断加热, 反复几次, 直到海藻酸钠溶化为止。
4．海藻酸纳溶液与酵母细胞混合： 将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至室温 , 加入已活化的酵母细胞, 进行充分搅拌, 使其混合均匀。
5．固定化酵母细胞：用滴管以恒定的速度，缓慢地将海藻酸钠酵母溶液滴加到配制好的CaC12 溶液中, 观察液滴在CaC12 溶液中形成凝胶珠的情形，浸泡30min左右。
6．凝胶珠滤出备用。 五、注意事项：
海藻酸钠在水中溶解的速度较慢, 需要通过加热促进其溶解。溶解海藻酸钠，最好采用小火间断加热的方法。 例如, 加热几分钟后, 从石棉网上取下烧杯冷却片刻, 并不断搅拌, 再将烧杯放回石棉网继续加热, 如此重复数次, 直至海藻酸钠完全溶化。如果加热太快, 海藻酸钠会发生焦糊。 六、思考题
利用固定化细胞与直接利用细胞有什么不同？
固定化酵母细胞的活性检测
一、实验目的：
学习和了解固定化细胞在实际中的应用。 二、 实验原理：
固定化技术是利用物理或化学方法，将酶或细胞固定在一定空间内的技术 , 包括包埋法、化学结合法和物理吸附法。一般来说 , 酶更适合采用化学结合和物理吸附法固定
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化, 而细胞多采用包埋法固定化。这是因为细胞体积大, 而酶分子很小，体积大的细胞难以被吸附或结合, 而酶分子容易从包埋材料中漏出。
本实验采用包埋法固定化酵母活细胞, 即将酵母活细胞均匀地包埋在不溶于水的多孔性载体中。常用的载体有明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素和聚丙烯酰胺等。本实验选用海藻酸钠作为包埋材料。
一、 试剂与材料： 1．10% 的葡萄糖溶液。 二、 实验步骤
1．将固定好的酵母细胞(凝胶珠)用无菌水冲洗2～3次。
2．将 150 mL 质量分数为 10% 的葡萄糖溶液转移到 200mL 的锥形瓶中 , 再加入固定好的酵母细胞, 置于30℃下发酵 12-24h。
3．观察用固定化酵母细胞进行葡萄糖溶液发酵的过程, 观察是否有气泡产生以及凝胶珠的沉浮状态, 闻闻是否有酵母发酵产生的酯香味和酒味。 五、思考题
1．请你创意一种固定化细胞的家庭应用方案。
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