鲁东大学生命科学学院 2010 生物技术专业《生物技术综合实验》实验指导
备注：在设计实验方案时，我们提倡同学们相互讨论，不支持相互参考，坚决反对相互抄袭。
三、对于教学控制过程，要求如下：
1、设计性实验的设计方案需经教师审阅签字后，方可进行实验操作； 2、实验原始记录需经教师审阅签字后，方算完成了实验操作过程。
3、学生交实验报告时，需把经签字的设计方案和原始记录作为报告的附件一并交来，如没有这两个附件视作未做实验。
4、为了督促学生认真学习，促进学习积极性，激励他们多做实验，做好实验，凡是学生首次未设计好实验方案的，可以重新设计；未做好实验的，可以重做实验；未写好报告的，可以重做报告。 四、注意
学生们可以多选做实验项目，也可以多次作实验，请同学们在实验中开拓思维，提出更多、更好的实验方法和建议，并欢迎大家提出新的实验项目与想法。我们愿与同学们共同努力把设计性、研究性实验教学更进一步的开展起来。
设计项目一、摇瓶发酵法生产柠檬酸
一、实验目的
了解柠檬酸发酵原理与过程，掌握柠檬酸液体发酵及中间分析方法。 二、实验原理
黑曲霉发酵法生产柠檬酸的代谢途径被认为是：黑曲霉生长繁殖时产生的淀粉酶、糖化酶首先将薯干粉或玉米粉中的淀粉转变为葡萄糖；葡萄糖经过酵解途径和HMP途径转变为丙酮酸；丙酮酸由丙酮酸氧化酶氧化生成乙酸和CO2，继而经乙酰磷酸形成乙酰辅酶A，然后在柠檬酸合成酶的作用下生产柠檬酸。黑曲霉在限制氮源和锰等金属离子条件下，同时在高浓度葡萄糖和充分供氧的条件下，TCA循环中的α-酮戊二酸脱氢酶受阻遏，TCA循环变成“马蹄型”，代谢流汇集于柠檬酸处，使柠檬酸大量积累并排出菌体外。其理论反应式为：
C6H12O6+1.5H2O → C6H8O7+H2O
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柠檬酸理论得率为106.7%，若以含一个结晶水的柠檬酸计为116.7%。 三、实验装置与流程 （1）实验装置与材料：
①装置：旋转式摇床、恒温培养箱、高速离心机（4000-6500r/min）。 ②菌种：黑曲霉CICC。
③材料：麸皮、马铃薯、薯干粉、蔗糖、玉米粉、大麦芽、大米、琼脂、淀粉酶（中温酶与高温酶）。
④器皿：15mL试管、100mL三角瓶、2000mL烧杯、500mL三角瓶、离心管若干。 ⑤试剂：0.1429M NaOH、1%酚酞试剂、斐林试剂甲、乙液、0.01%标准葡萄糖溶液。 （2）实验流程
保藏菌株→活化菌株（斜面培养）→200mL三角瓶麸曲培养→500-1000mL三角瓶液体发酵。 （3）斜面培养基
①马铃薯琼脂培养基：去皮马铃薯200g切成小块，加水约500Ml，煮沸30min，然后用纱布过滤，滤液加蔗糖20g,琼脂20g,溶化后自来水定容至1000mL，分装于经干热灭菌后的带棉塞试管内。于121℃灭菌20min，取出摆成斜面备用。
②麦芽汁琼脂培养基：2/3大麦芽和1/3大米磨碎成粉，按麦芽粉：水=1：4比例加水，置60℃下糖化4h至碘液显无色，然后离心15min，获得麦芽汁，调整浓度5°Bx，添加20g/L琼脂，分装于经干热灭菌后带棉塞试管内。于121℃灭菌15-20min，取出摆成斜面备用。
③一级种子（麸曲种子）培养基 A． 含麸皮的查氏培养基（g/L）：
蔗糖30、KNO3 1.0、K2HPO4 1.0、MgSO4·7H2O 0.5、KCl 0.5、FeSO4· 7H2O 0.01；调节pH 7.0~7.2，加水定容至1000mL，添加800g麸皮，搅拌至无干粉又无结团，分装入8-10个500mL三角瓶中，塞入8层纱布并包扎好。于121℃灭菌30min，趁热摇散，冷却至35℃备用。
B．麸曲培养基：
取新鲜麸皮，用60目筛子去细粉，按麸皮：水=1：（1.1-1.3）比例加水，拌匀至无干粉又无面团，或用水洗麸皮表面，挤至有水感而滴水为宜。上述麸皮装入500mL三角瓶中，每瓶装20g湿料，塞入8层纱布并包扎好。于121℃灭菌30min，趁热摇散，冷却至35℃
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备用。
④摇瓶发酵培养基：
方案1 取细度为40目以上的薯干粉6-8g，装入500mL三角瓶中，再加入100mL水和中温α-淀粉酶（5u/g甘薯粉），于75-80℃下液化15min，瓶口塞有8层纱布包扎好，于121℃灭菌20min，趁热摇散，冷却至35℃备用。
方案2 取细度为60目以上的玉米粉300g装入2000mL烧杯中，加入1000mL水和耐高温的α- 淀粉酶10—20 U/ g 玉米粉，加热至85 ℃,保温30 min , 碘液不变色后, 继续加热至100 ℃煮沸5 min ,趁热经过两层纱布过滤，滤液加水冷却并调整糖度至15-20%和蛋白质含量不超过4g/L,取过滤清液40mL分别装入500mL三角瓶中，瓶口塞有8层纱布包扎好，于121℃灭菌20min，趁热摇散，冷却至35℃备用。
方案3 去离子葡萄糖140g，硝酸铵2.5g，磷酸二氢钾2.5g，7水硫酸镁2.5g，Cu2＋ 0.06mg，Zn2+ 25mg，Fe2+ 1.3mg，Mn2＋ 1.0mg，去离子水至1000mL，pH 3.8。 四、实验步骤和方法 （1）种子制备
①斜面种子制备：用接种环挑取冰箱保存的斜面菌种一环于斜面培养基上，于30℃恒温箱中培养3～5d，待长出大量黑色孢子后，即成为活化的斜面菌种。
②孢子悬浮液制备：用无菌移液管吸取5mL无菌水至黑曲霉斜面上，用接种环轻轻刮下孢子，装入含有玻璃球的三角瓶中，盖好塞子震荡数分钟。每支斜面的孢子悬浮液可接2～3瓶麸曲三角瓶。
③麸曲孢子培养：吸取孢子悬浮液2mL接入上述麸曲培养基中，然后摊开纱布、扎好，并在掌心轻拍三角瓶，使孢子与培养基充分混合，于30～32℃下恒温培养1d后，再次拍匀，每隔12～24h摇瓶一次，孢子长出后停止摇瓶，这样继续培养4～5d，即成种曲。 （2）摇瓶发酵
将麸曲孢子（或直接将斜面种子）接种于上述方案1、方案2的摇瓶发酵培养基中。接种量：一支斜面接种4-5瓶，一瓶麸曲孢子接种20～35瓶。500mL三角瓶装液量为40mL，于转速为200r/min（24h前为100 r/min，24h后为200 r/min）、300 r/min（24h前为100 r/min，24h后为300 r/min）旋转摇床上，30℃培养3～4d.
方案3：装液量：50ml/500ml三角瓶。接种量：8×104ml个孢子/ml发酵液。置于旋转式摇床（振幅25mm，转速270r/m）30℃，震荡培养9天。（此可获得72%的糖转化为柠檬酸，菌体为小的沉淀体，直径0.1~0.5mm）
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（3）发酵检测
①发酵0、24、48、72、96h分别各取下两瓶检测残糖、柠檬酸含量，以观察发酵过程中的黑曲霉的耗糖与柠檬酸的生成速率。
②柠檬酸含量的检测：一般测定发酵过程中的总酸，采用0.1429mol/L NaOH溶液滴定发酵过滤清液。
③总糖和残糖测定采用斐林试剂法测定，见附录。 五、实验结果与记录
黑曲霉柠檬酸摇瓶液体发酵 发酵时间/h 0 样本 瓶1 瓶2 24 瓶1 瓶2 48 瓶1 瓶2 72 瓶1 瓶2 96 瓶1 瓶2 残糖/% 柠檬酸含量/% 糖酸转化率/% 反应条件：24h前为100 r/min，24h后为200 r/min。
设计项目二、 固体发酵法生产柠檬酸
一、实验目的
1、学习掌握固体发酵的原理和方法。
2、学习掌握柠檬酸发酵的原理、过程和产物提取的方法。 二、实验原理
我国在20世纪40年代初期开始浅盘发酵生产柠檬酸，60年代后开始采用深层发酵法生产柠檬酸。原理同实验四。能够产生柠檬酸的微生物很多，青霉、毛霉、木霉、曲霉及
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葡萄孢霉中的一些菌株都能利用淀粉质原料大量积累柠檬酸。本实验是以玉米粉为原料，利用黑曲霉菌种经过固体发酵生产柠檬酸。 三、仪器、材料和试剂 （1）仪器
恒温培养箱、振荡器、离心机 （2）材料
黑曲霉、麸皮、米糠、玉米粉、蔗糖、硝酸钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钾、硫酸亚铁、碳酸钙、硫酸、正丙醇、浓氨水、活性炭、阳离子树脂、500ml三角瓶、搪瓷盘、新华3号滤纸、毛细管、分液漏斗、层析缸、马铃薯等。 （3）培养基配方 查氏培养基：
蔗糖30g，KNO3 1g，K2HPO4 1g，MgSO4.7H2O 0.5g，KCl 0.5g，FeSO4.7H2O 0.01g，调节pH值至7.0～7.2，加水定容至1000ml。 一级种子培养基
含麸皮（10%）的查氏培养基。 二级种曲培养基
麸皮30g，米糠12 g，水20 ml，调pH 至5.0，装入500 ml三角瓶中， 8层纱布封口。 发酵培养基
玉米粉400，麸皮50，米糠50，水200mL，拌匀后装入大搪瓷缸。 上述培养基经高压蒸汽灭菌后备用。 （4）试剂配制 ①0.1%酚酞指示剂 ②0.04%溴甲酚绿乙醇 ③0.1 mol/L的NaOH溶液 ④2%标准柠檬酸溶液
⑤展开剂：正丙醇:浓氨水=3:2（v/v） 四、实验步骤及方法
1．种子制备
(1) 一级种子的制备：用接种环挑取冰箱中保存的菌种接种于一级种子培养基斜面上，于28℃恒温培养箱培养3～5天，待长成大量黑色孢子后即成为一级种子。
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