鲁东大学生命科学学院 2010 生物技术专业《生物技术综合实验》实验指导
1. 流程：
谷氨酸——加水、活性炭、碳酸钠——中和——脱色——过滤——二次脱色——滤液——三次脱色——过滤——浓缩结晶——干燥 2. 操作
（1） 工艺条件：
湿谷氨酸：水=1：2
湿谷氨酸：碳酸钠=1：0.3~0.34 湿谷氨酸：活性炭=1：0.01 T=60℃，pH6.4（用试纸测）
（2） 在不锈钢桶内加入清水及活性炭升温至65℃，开始搅拌（60r/min）。投
入谷氨酸，缓慢、逐步加入碳酸钠中和到pH6.4（试纸），加热至65℃，继续搅拌约30min。
（3） 将澄清的脱色液加入旋转蒸发器（加料小于二分之一），真空度在
600mmHg以上，温度小于70℃，浓缩至34~34.5波美度，升温至80℃放料，冷却，搅拌2~3h后开冷却水降温，至室温。 （4） 分离：抽滤（工业滤布做介质）
（5） 烘干：鼓风干燥箱（温度小于60℃），即可得到味精原粉。
五、思考题
分析影响谷氨酸结晶的因素？
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综合项目四、红曲发酵及红曲色素的提取
实验十一、红曲液体菌种的制备
一、实验目的
了解红曲菌液体菌种的制备方法, 为红曲发酵实验准备液体种子。 二、实验原理
红曲霉菌是一种好氧性微生物, 除了能进行固体浅盘培养外, 还可以用液体摇瓶培养
的方法来获得种子。
液体菌种生产具有纯度高、活力强、繁殖快的特点，接种到固体培养料内有流动性好、萌发点多，菌丝生长迅速等特种点。液体菌种应用于生产与固体菌种相比有以下优点：菌种生产周期短；接种后，萌发点多；接种方便、成本低；适宜工厂化生产。液体菌种为固态发酵的集约化、标准化生产创造了更好的条件。 三、实验器材与试剂
1．菌种：红曲5003
2．玉米面液体培养基（g/L）：蛋白胨 20；玉米面 20；酵母浸粉 10；硫酸镁0.5；磷酸氢二钾 1；硫酸亚铁 0.1；pH 6.0。
3．恒温摇床, 超净工作台, 高压蒸汽灭菌锅等。
四、实验步骤
（1） 配制制玉米面液体培养基。500mL 三角瓶中装玉米面液体培养基 150mL, 包扎后
0.lMPa 灭菌 20 分钟。
（2） 玉米面液体培养基灭菌冷却后 , 每瓶中接入 1/4 支红曲斜面菌苔 ( 注意无菌
操作 ) 。
（3） 接种后置30℃恒温摇床中 180 rpm 摇瓶培养 3天。 五、思考题 :
比较液体种子与固体种子的优缺点。
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实验十二、红曲固体发酵
一、实验目的
了解固体发酵的工艺过程 , 在实验室中小规模制备红曲。
二、实验原理
红曲霉菌属真菌界(Eumycophyta)、子囊菌门(Ascomycota)、真子囊菌纲
(Euascomycetes)、散子囊菌目(Eurotiales)、红曲菌科(Monascaceae)、红曲菌属(Monascus)。由红曲霉接种于大米发酵得到的红曲是我国古代的一大发明，称为丹曲，至今已有1000多年的历史，很早就应用于食品着色、食品发酵以及中医中药。
红曲霉作为红曲的生产菌, 以其可产生大量天然色素而著称。红曲的应用主要有三方面：食品色素、药物和发酵食品。红曲色素是红曲霉在生长代谢过程中产生的天然色素，是红曲霉的次生代谢产物，具有热稳定性好，蛋白着色力强，色调柔和，可以提高加工制品对光和氧稳定等优点；而且红曲色素无毒性、无致突变作用，安全性很高，因此红曲可提供安全性高的天然色素。
1979年，日本学者远藤章从红曲发酵液中发现并分离得到能显著抑制体内胆固醇合成的活性物质Monacolin K后，人们开始对天然红曲及Monacolin类化合物给予了新的广泛关注。美国FDA于1987年正式批准美降脂药(洛伐他汀，即Monacolin K)用于临床。迄今为止，美国和日本等已开发出一系列他汀类药物如Lovastatin、Provastatin、Simvastatin和Atorvastatin等，其主要成分即为Monacolin类化合物。我国用红曲开发的降血脂药物及保健食品有血脂康、脂必妥和健心宝等。药理及临床实验显示，红曲不但有降血脂、降血压、降血糖功效，而且还有明显抑菌、增强免疫力、抗疲劳的作用。
国内红曲的生产现在普遍采用固态发酵的方法。 三、实验器材与试剂
蒸锅, 浅盘等。制曲原料 : 优质籼米。
四、实验步骤
1． 浸米 :25 ℃以上浸米 5—8h, 大米吸收水分约在 28%～30% 。
2．蒸米: 将浸好的米用清水淋去米浆水, 沥干, 即可蒸米。上汽火力要强, 待全部圆气以后，蒸煮3～5min, 出饭率在 135%, 饭粒呈玉色, 粒粒疏松, 不结团块。蒸米不能熟透。
3．摊凉接种: 将蒸熟的曲料倒在超净工作台上迅速打碎团块, 摊平冷却到 30～32 ℃
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然后, 每 1kg 米接种液体种子20ml, 充分翻拌混合均匀,操作要迅速, 以减少杂菌污染。 4．发酵: 将曲料摊在曲盘内, 厚度约 3-5cm。32～33 ℃保温保湿培养。每天翻曲一次，观察到曲粒表面略有干皮、少数曲粒略有微红斑点等现象时即可“吃水”, 使曲粒吸收一定水分, 以利菌丝逐渐向内生长。吃水方法: 一边拌曲，一边向曲盘中喷洒无菌水, 使曲粒表面润湿并微有发胀。培养3天后米粒逐渐成红色。观察记录色素产生的过程。
培养5-7天后，固态发酵结束的红曲置于鼓风干燥箱内50~60℃鼓风干燥。 5．成品质量检查
外观检查 : 曲粒表层光滑紫红, 曲粒中心呈玉色, 不得有空心和红心。曲粒断面菌丝均匀，具有红曲特有的曲香, 不得有酸气等不正常气味。
生物与理化项目检查: 水分12%以下 , 容量 (l00mL)44.5～46.5g, 淀粉含量
５９％～６２%, 无细菌和其他霉菌污染。 五、注意事项 :
注意发酵阶段控制品温。
六、思考题 :
影响红曲质量的因素有哪些 ?
实验十三、红曲色素的提取及红曲色价测定
一、实验目的
熟悉从红曲中分离代谢产物的方法，以及掌握红曲色素色价的测定方法。
二、实验原理:
红曲色素分为黄色素、橙色素和紫红色素，其中黄色素包括红曲素(Monascin)和黄红曲素(Ankaflavin)，橙色素包括红斑红曲素(Rubropunctatin)和红曲玉红素(Monascorubin)，紫红色素包括红斑红曲胺(Rubropunctamine)和红曲玉红胺(Monascoru- bramine)。凡色素的呈色都与其结构有着密切的关系，结构的形式与变化内在决定着物质的呈色与变色。
大米经红曲菌固体发酵后产生了一系列红曲菌的代谢产物, 但这些产物的量非常少, 大米仍占固体发酵产物的绝大部分体积, 为了降低运输成本, 常常要对红曲菌的代谢产物进行提取和浓缩。红曲的代谢产物中既有水溶性组分, 也有脂溶性组分, 因此可用 80%
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的丙酮(丙酮:水 =80：20)抽提。用 HCl 或 NaOH 处理可以将其中的酸溶性组分、碱溶性组分和中性组分分开。选择溶剂一般要注意以下四点：① 溶剂对所需成分的溶解度要大，对杂质溶解度要小，或反之。② 溶剂不能与天然药物成分产生化学反应，即使反应亦属于可逆性的。③ 溶剂要经济易得，并具有一定的安全性。④ 沸点宜适中，便于回收反复使用。
红色素能溶于80% 的乙醇中 , 可通过萃取从米粒中提取出来, 红曲色素在505nm 处有最大的吸收峰, 可用分光光度计来测定。 三、实验器材与试剂
旋转蒸发仪, 分液漏斗, 乙酸乙酯, 丙酮等，分光光度计,水浴锅,量筒,80%乙醇等
四、实验步骤 （一）色素提取：
1、取 200g 固体发酵之红曲, 在植物粉碎机中将其粉碎；
2、将红曲粉放于 500mL 三角瓶中, 加入提取液(丙酮 : 水 =80:20)300mL； 3、室温下浸提 1 天, 每隔 2 小时摇动一次, 过滤； 4、沉淀用同样提取液洗涤 2 次, 每次 100ml, 合并滤液； 5、在旋转蒸发仪中减压蒸去丙酮( 尚有水分 )；
6、用 l mol/L HCl 调残留液(约 l00mL)的pH至3.0, 加至分液漏斗中； 7、用 150mL 醋酸乙酯分次抽提；
8、以同样方法按下图分离碱(溶)性组分、中性组分和酸(溶)性组分, 观察各组分的颜色；
9、将各分离到的组分在旋转减压蒸发仪中蒸去溶剂, 低温保存。
（二）红曲色价测定：
1、称取红曲米样品 0.5g, 放入带有刻度的 lO mL 具塞试管中； 2、加入 80%的乙醇 8 mL, 摇匀, 60℃水浴保温萃取0.5h；
3、取出冷却, 用普通定性滤纸过滤入lO mL 量筒中, 用 80% 乙醇洗涤残渣 2 次, 合并滤液, 并用 80% 乙醇定容至10mL；
4、以 80% 乙醇作对照, 在 505nm 波长下, 用 lcm 比色皿测定样品的吸光度。 5、计算: 红曲色价(以lg样品计)=A505×lO×2 注意：发酵后期, 若红色素产生量多, 可稀释后测定。 五、注意事项 :
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