PCR实验室试剂质检标准操作程序 发布部门:XXXXXX医院检验科 分发范围: 检验科PCR室 编写者: XXX
1．目的：保证每批用于临床实验的试剂的质量良好，符合要求。 2．适用范围：各种用于临床实验的核酸扩增荧光检测试剂。 3．负责人：XXXX 4．程序：
4．1 收到试剂后，目测试剂是否处在冻存状态。
4．2 核对试剂品种和数量并检查包装：外包装（厂名厂址、批准文号、批号和有效期等）；内包装
（试剂瓶完整性、试剂配备品种完整性、使用说明书有否等）。
4．3 及时将试剂转入－20℃冰箱保存。将上述检测核对情况在记录表上登记。
4．4 最迟在前批次试剂存量尚可维持常规实验一周时，按如下要求对新批号试剂进行效验实验。 4．5 效验实验：
4．5．1 要求设置：空白对照、阴性对照、阳性对照、室内质控各一，阳性标准品梯度（104、105、106、107）。
4．5．2 出现如下情况中任何一种的，判断为试剂不合格，不能用于临床检测：
a）空白对照出现扩增。如扩增曲线CT值大于25，需重复实验确证试剂污染。
b）阳性对照和阳性标准品均未检出，或阳性对照未检出而阳性标准品检出率大幅下降，表示试剂失效或检测灵敏度大幅下降。
4．5．3 阳性对照未检出，阳性标准品检测正常，提示样品提取液可能存在问题。重复新旧提取液阳性对照实验，确定提取液失效问题。更换提取液后该批试剂方可使用。
4．5．4 空白对照无扩增，阴性对照有扩增，排除其他污染可能性后，提取液存在污染可能。单独用提取液点样上机，出现扩增，需更换提取液后方可使用该批试剂。
4．5．5 阳性对照检出，阳性标准品未检出或扩增曲线明显系统性CT值偏大5个循环以上。提示阳性标准品存在问题。更换阳性标准品后该批试剂方可投入使用。
4．5．6空白对照、阴性对照无扩增，阳性对照正常检出，阳性标准品导出的标准曲线之斜率（－2.9～－3.9）、截距（26～34）、相关性（﹤－0.99）均在使用范围内，表明该批试剂良好，可以投入
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审核者:XXX 批准者:XXX 文件编号:PCR(N)-SOP-007 版本/修订号: A/0 实施日期: 2012年5月1日
临床使用。
4．6 将实验结果归入记录。 6 相关表格
试剂入库使用记录表，编号PCR(N)-SOP-007-01。 试剂质检记录表，编号PCR(N)-SOP-007-02。
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乙型肝炎病毒核酸定量检测标准操作程序 发布部门:XXXXX医院检验科 分发范围: 检验科PCR室 编写者: XXX 审核者:XXX 批准者:XXX 文件编号:PCR(N)-SOP-101 版本/修订号: A/0 实施日期: 2012年5月1日 7 项目名称
乙型肝炎病毒核酸定量检测
8 检验方法名称
TaqMan荧光定量检测
9 方法学原理
PCR扩增时加入一对乙型肝炎病毒DNA特异性引物，同时加入一个特异性的、能与PCR产物杂交的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团（R）和一个荧光淬灭基团（Q）。探针完整时，R基团发射的荧光信号被Q基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使R荧光基团和Q荧光基团分离，Q基团对R基团的抑制吸收作用消失，荧光监测系统就可接收到R基团的荧光信号。每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成。被切割产生的荧光分子数与PCR产物的数量成比例，这样就实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。因此根据PCR反应液的荧光强度即可计算出初始模板的数量。
10 标本要求
10.1 血清：用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升，注入无抗凝剂普通试管，待凝固后1500r/min离心5分钟，吸取上层血清，转移至1.5ml灭菌离心管；
10.2 血浆：用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升，注入EDTA或枸橼酸钠抗凝剂的试管，轻轻颠倒混匀5~10次，使抗凝剂与静脉充分混匀，5~10分钟后即可分离出血浆，转移至1.5ml灭菌离心管；
10.3 标本保存：标本可立即用于测试，也可以保存于-20℃待测，保存期为6个月。
11 试剂
11.1 试剂名称：乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光探针法） 11.2 生产厂家：中山大学达安基因股份有限公司； 11.3 试剂货号：#DA-B051； 11.4 包装规格：20人份/盒； 11.5 试剂成份: 组成部分 DNA浓缩液（2000μl/管） DNA提取液（500μl/管） HBV PCR反应液（400μl/管） Taq酶（60μl/管） HBV临界阳性质控品（200μl/管） 数量 1管 2管 2管 1管 1管 主要组成成份 PEG6000、NaCl NaOH、Tris-HCl、（PH8.0）、TritonX-100、NP-40、Chelex-100、EDTA（PH8.0） PCR反应缓冲液、上下游引物、荧光探针 Taq酶原液、dNTPs 灭活的HBV阳性血清（1×104IU/ml） 第 11 页/共 93 页
组成部分 HBV强阳性质控品（200μl/管） 阴性质控品（250μl/管） 数量 1管 1管 主要组成成份 灭活的HBV阳性血清（1×107IU/ml） HBV阴性血清 含有HBV扩展目的基因片断的重组质粒（1.0×104IU/ml） 含有HBV扩展目的基因片断的重组质粒（1.0×105IU/ml） 含有HBV扩展目的基因片断的重组质粒（1.0×106IU/ml） 含有HBV扩展目的基因片断的重组质粒（1.0×107IU/ml） HBV阳性定量参考品（1.0×104IU/ml）10μl/管 1管 紫色 HBV阳性定量参考品（1.0×105IU/ml）10μl/管 1管 黄色 HBV阳性定量参考品（1.0×106IU/ml）10μl/管 1管 蓝色 HBV阳性定量参考品（1.0×107IU/ml）10μl/管 1管 绿色 11.6 试剂储存条件：保存于—20℃，有效期6个月。
12 仪器
ABI 7500全自动基因扩增检测仪
13 操作步骤
13.1 DNA提取
13.1.1 标本处理（血清和血浆标本处理相同，在样本处理区操作） 13.1.1.1 取100μl血清加入等量DNA，振荡器振荡混匀5秒； 13.1.1.2 12000r/min离心10min；
13.1.1.3 去上清，沉淀中加入30μl DNA提取液，振荡器剧烈振荡混匀5~10秒，瞬时离心数秒，100℃恒温处理10±1分钟；
13.1.1.4 12000r/min离心5min，备用。 13.1.2 阴性质控品处理
取出阴性质控品，8000rpm离心数秒，吸50μl至0.5ml灭菌离心管中，加入50μl DNA提取液充分混匀，100℃恒温处理10±1分钟；12000r/min离心5min，备用。
13.1.3 HBV临界阳性质控品处理（同阴性质控品）； 13.1.4 HBV强阳性质控品处理（同阴性质控品）；
13.1.5 HBV阳性定量参考品处理：8000rpm离心数秒，备用； 13.2 PCR扩增
13.2.1 试剂准备（在试剂准备区操作）：按比例（HBV PCR反应液40μl/人份+ Taq酶3μl/人份）取相应量的PCR反应液及Taq酶，充分混匀后按43μl/管分装至0.2ml离心管中备用。
13.2.2 加样：向准备好试剂的0.2ml离心管中，分别加入处理后的样品（包括样本、阴性质控品、临界阳性质控品和强阳性质控品）上清液2μl，或直接加入阳性定量参考品2μl，8000rpm离心数秒，放入仪器样品槽。
13.2.3 设置PCR循环扩增程序如下
93℃ 2分钟 预变性；
93℃ 45秒 → 55℃ 60秒 10个循环 93℃ 30秒 → 55℃ 45秒 30个循环
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14 结果判断：
14.1.1 在Results/Amplification 页面查看反应曲线，分析结果时，基线（baseline）取为12-18个循环的荧光信号，此时的阈值（threshold）约为400。
14.1.2 4管阳性标准管、临界阳性对照管的荧光强度对应反应循环数曲线（ΔRn vs. Cycle）应呈较典型的S型曲线，阴性对照管则无此特征，否则实验视为无效。
14.1.3 根据预先输入的5个阳性参考品浓度，仪器自动以阳性参考品基因拷贝浓度的对数值为横坐标，以其实际测得的Ct值为纵坐标，作标准曲线，相关系数应大于等于0.990，否则应视为实验无效。
14.1.4 定量结果分析：质控、标准曲线均满足要求时，可对样品进行定量分析。分析数据时，根据标准曲线自动计算未知标本的相应基因拷贝浓度。
14.1.5 如果增长曲线不呈S型或Ct值=30，则判样品的HBV DNA总含量小于检测极限。 14.1.6 如果增长曲线呈S型曲线且Ct值<30，则按以下方法判断： a ) 若定量数值在线性范围内：1.00E+002≤C≤1.00E+008，则样品HBV DNA总含量为C IU/ml； b ) 如果定量数值在线性范围外，有两种情况：
i. C>1.00E+008，则样品HBV DNA总含量>1.0×108 IU/ml。如果需要精确定量结果，
可将提取后的样品稀释至线性范围内再检测； ii. C<1.00E+002，则样品的HBV DNA总量为C IU/ml，定量数值供参考。
15 质控
a ) 阴性质控品：增长曲线不呈S型曲线或Ct值=30； b ) 阳性质控品：增长曲线呈S型曲线，且强阳性质控品定量参考值在1.0×106IU/ml~2.0×
107IU/ml范围，临界阳性质控品定量参考值在2.0×102IU/ml~2.0×104IU/ml范围；（参考值为仪器自动分析计算出的数值）； c ) 阳性定量参考品：全部阳性，且线性相关系数0.97≤|r|≤1； d ) 以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。
16 参考范围
低于检测下限
17 性能指标
检测限：1.0×102IU/ml
线性范围：1.0×102IU/ml~1.0×108IU/ml
18 临床意义
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