18.1 观察抗病毒药物疗效，指导用药
血循环中HBV DNA水平与HBV感染者病情和预后的关系密切，尤其是急性和慢性乙型肝炎患者。研究发现HBV DNA一直保持较高水平的急性肝炎患者易慢性化，而HBV复制水平较高的慢性肝炎患者不仅对干扰素治疗的反应性差，而且肝组织炎症反应更明显，病情更重，更易发生肝硬化和肝癌。根据《2000 年拉米夫定临床应用指导意见》，中国慢性乙型肝炎病人治疗的目的主要就是降低血清HBV DNA，诱导HBeAg血清转换，使ALT正常化，改善肝脏组织学病变，改善疾病症状、体征，提高生活质量，降低肝硬化和肝癌的发生率。同时血清的HBV DNA滴度的动态变化还可在临床上对用药的剂量、用药时间以及是否需要联合用药等提供参考。
18.2 器官移植中的作用
肝脏器官移植是目前肝硬化晚期治疗的唯一方法，但有约86%以上既往HBsAg携带者术后HBsAg重新出现。检测HBV DNA 可用于观察免疫受损患者的HBV感染状况。肝移植后乙肝主要是复发，再感染为次要因素。特别是移植前HBV复制水平高者，复发的几率更高。定量检测HBV DNA对肝移植术后的跟踪观测具有较好的临床价值。
18.3 对阻断母婴传播的监测
联合应用高放价免疫球蛋白和乙肝疫苗时有效地阻断母婴传播，但仍有一些婴儿对疫苗呈低反应，检测婴儿血循环中HBV DNA可对此进行监测，分析阻断失败的原因。
19 注意事项
19.1 实验室管理应严格按照PCR基因扩增实验室的管理规范，实验人员必须进行专业培训，实验过程严格分区进行（试剂准备区、标本制备区、扩增和产物分析区），所用消耗品应灭菌后一次性使用，实验操作的每个阶段使用专用的仪器和设备，各区各阶段用品不能交叉使用；
19.2 为试剂和标本制备阶段提供生物安全柜，实验过程中穿工作服，带一次性手套，使用自卸管移液器；
19.3 对每次实验进行质量控制；
19.4 试剂使用前要完全解冻，但应避免反复冻融；
19.5 试剂盒DNA提取液内含不溶于水的物质，取样时需用加样器充分混匀后吸取。如出现因吸头嘴部太细不能吸取或取样后堵塞吸头现象，可先用洁净无污染的剪刀将吸头嘴部剪去一截；
19.6 提取的DNA可于—20℃保存6个月； 19.7 “C”表示样品的浓度或含量；
19.8 标本制备区所用过的吸头请打入盛有消毒剂的容器，并与废弃物一起灭菌后方可丢弃； 19.9 实验完毕用10%次氯酸或75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；
19.10 所有检测样品应视为具有传染性物质，操作和处理均需符合相关法规要求：卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通用准则》和《医疗废物管理条例》。
20 参考文献
中华人民共和国卫生部医政司编．全国临床检验操作规程(第三版) ．南京：东南大学出版社，2006
乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒（PCR—荧光探针法）说明书.2009年7月，第一版/0 批准记录 批准人 批准时间 有效期 □1年；□其他： □1年；□其他： 第 14 页/共 93 页
□1年；□其他： □1年；□其他： □1年；□其他： 第 15 页/共 93 页
丙型肝炎病毒核酸检测标准操作程序 发布部门:XXXX医院检验科 分发范围: 检验科PCR室 编写者: XXX 审核者:XXX 批准者:XXX 文件编号:PCR(N)-SOP-102 版本/修订号: A/0 实施日期: 2012年5月1日 1 项目名称
丙型肝炎病毒核酸检测
2 检验方法名称
TaqMan荧光定性检测
3 方法学原理
对丙肝病毒进行逆转录反应生成cDNA，PCR扩增时加入一对丙型肝炎病毒cDNA特异性引物，同时加入一个特异性的、能与PCR产物杂交的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团（R）和一个荧光淬灭基团（Q）。探针完整时，R基团发射的荧光信号被Q基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使R荧光基团和Q荧光基团分离，Q基团对R基团的抑制吸收作用消失，荧光监测系统就可接收到R基团的荧光信号。每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成。被切割产生的荧光分子数与PCR产物的数量成比例，这样就实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。因此根据PCR反应液的荧光强度即可计算出初始模板的数量。
4 标本要求
4.1 血清：用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升，注入无抗凝剂普通试管，待凝固后1500r/min离心5分钟，吸取上层血清，转移至1.5ml灭菌离心管；
4.2 血浆：用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升，注入EDTA或枸橼酸钠抗凝剂的试管，轻轻颠倒混匀5~10次，使抗凝剂与静脉充分混匀，5~10分钟后即可分离出血浆，转移至1.5ml灭菌离心管；
4.3 标本保存：分离后的血清或血浆在2~8℃条件下保持不应超过72小时；-20℃可保存1个月；要长期保存的，需分装后储存于-70℃。
5 试剂
5.1 试剂名称：丙型肝炎病毒核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法） 5.2 生产厂家：XXXXXXX 5.3 试剂货号：#DA-B070； 5.4 包装规格：10人份/盒； 5.5 试剂成份: 组成部分 RNA提取液A（100μl/管） RNA提取液B（4000μl/管） HCV PCR反应液Ⅰ（180μl/管） 数量 1管 1管 1管 主要组成成份 二氧化硅、DEPC水（pH2.0） GuSCN、Tris-HCl（pH6.4）、EDTA（pH8.0）、Triton-100 引物、dNTPs、5×逆转录缓冲液 第 16 页/共 93 页
组成部分 逆转录酶系（20μl/管） HCV PCR反应液（400μl/管） Taq酶（30μl/管） DEPC H2O（200μl/管） 阴性质控品（250μl/管） HCV临界阳性质控品（200μl/管） HCV强阳性质控品（200μl/管） 数量 1管 1管 1管 1管 1管 1管 1管 主要组成成份 mMLV逆转录酶、RNasin 上下游引物、荧光探针、dNTPs、5×PCR反应缓冲液、双蒸水 Taq酶原液、Tris-HCl（pH8.0）、KCl、EDTA（pH8.0）、DTT、丙三醇 DEPC H2O HCV阴性血清 HCV强阳性血浆（2×107IU/ml）稀释1600倍制成 HCV强阳性血浆（2×107IU/ml）稀释16倍制成 含有HCV扩展目的基因片断的重组质粒（1.0×105IU/ml） 含有HCV扩展目的基因片断的重组质粒（1.0×106IU/ml） 含有HCV扩展目的基因片断的重组质粒（1.0×107IU/ml） 含有HCV扩展目的基因片断的重组质粒（1.0×108IU/ml） HCV阳性定量参考品（1.0×105IU/ml）10μl/管 1管 红色 HCV阳性定量参考品（1.0×106IU/ml）10μl/管 1管 黄色 HCV阳性定量参考品（1.0×107IU/ml）10μl/管 1管 蓝色 HCV阳性定量参考品（1.0×108IU/ml）10μl/管 1管 绿色 5.6 试剂储存条件：保存于—20℃，有效期6个月。
6 仪器
ABI 7500全自动基因扩增检测仪
7 操作步骤
7.1 RNA提取
7.1.1 阴性质控品处理
7.1.1.1 取出阴性质控品，8000rpm离心数秒；
7.1.1.2 取灭菌的0.5ml离心管加入10μlRNA提取液A（充分混匀后吸取），加入100μl阴性质控品，再加入200μlRNA提取液B，振荡混匀，室温放置5分钟，8000rpm离心1分钟，小心吸去上清；
7.1.1.3 加200μlRNA提取液B，充分混匀（用移液器吹打），000rpm离心1分钟，小心吸去上清；
7.1.1.4 加预冷的75%乙醇400μl，充分混匀，8000rpm离心1分钟，小心吸去上清； 7.1.1.5 加预冷的75%乙醇400μl，充分混匀，8000rpm离心1分钟，小心吸去上清； 7.1.1.6 打开管盖，65℃干燥10分钟，盖上管盖待用于逆转录。 7.1.2 标本处理（血清和血浆标本处理相同）
7.1.2.1 取灭菌的1.5ml离心管加入10μl RNA提取液A（充分混匀后吸取），加100μl血清，再加入200μl RNA提取液B，振荡混匀，室温放置5分钟，8000rpm离心1分钟，小心吸去上清；
7.1.2.2 一下步骤同“阴性质控品处理”的7.1.1.3~7.1.1.6. 7.1.3 HCV临界阳性质控品处理（同阴性质控品）； 7.1.4 HCV强阳性质控品处理（同阴性质控品）；
7.1.5 HCV阳性定量参考品处理：8000rpm离心数秒，备用； 7.2 逆转录
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7.2.1 向干燥后的沉淀管加入18μl PCR反应液Ⅰ打匀，再加逆转录酶系2μl，振荡混匀； 7.2.2 37℃放置45分钟，95℃加热3分钟。8000rpm离心1分钟，待用。 7.3 PCR扩增
7.3.1 试剂准备（在试剂准备区操作）：按比例（HCV PCR反应液40μl/人份+ Taq酶3μl/人份）取相应量的PCR反应液及Taq酶，充分混匀后按43μl/管分装至0.2ml离心管中备用。
7.3.2 加样：向准备好试剂的0.2ml离心管中，分别加入逆转录后的样品（包括样本、阴性质控品、临界阳性质控品和强阳性质控品）上清液5μl，或直接加入阳性定量参考品5μl，8000rpm离心数秒，放入仪器样品槽。
7.3.3 设置PCR循环扩增程序如下
93℃ 2分钟 预变性；
93℃ 45秒 → 55℃ 60秒 10个循环 93℃ 30秒 → 55℃ 45秒 30个循环
8 结果判断：
8.1 如果增长曲线不呈S型或Ct值=30，则判样品的HCV RNA总含量小于检测极限。 8.2 如果增长曲线呈S型曲线且Ct值<30，则按以下方法判断： a ) 若样品的C<1.00E+003，则样品HCV RNA总含量<1.0×103 IU/ml。 b ) 若样品的1.00E+003≤C≤1.00E+008，则样品HCV RNA总含量为C IU/ml； c ) 若样品的C>1.00E+008，则样品HCV RNA总含量>1.0×108 IU/ml。如果需要精确定量结果，
可将提取后的样品稀释至线性范围内再检测；
9 质控
a ) 阴性质控品：增长曲线不呈S型曲线或Ct值=30； b ) 阳性质控品：增长曲线呈S型曲线，且强阳性质控品定量参考值在5.0×106IU/ml~5.0×
108IU/ml范围，临界阳性质控品定量参考值在2.0×103IU/ml~5.0×105IU/ml范围；（参考值为仪器自动分析计算出的数值）； c ) 阳性定量参考品：增长曲线呈S型曲线，Ct值<27，且线性相关系数0.97≤|r|≤1； d ) 以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。
10 参考范围
低于检测下限
11 性能指标
检测限：1.0×103IU/ml
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