5.5 试剂成份： 组成部分 DNA提取液（500μl/管） HPV6,11 PCR反应液（400μl/管） Taq酶（60μl/管） HPV6,11阴性质控品（500μl/管） HPV6,11强阳性质控品（200μl/管） HPV6,11临界阳性质控品（200μl/管） HPV6,11阳性定量参考品（1.0×104基因拷贝/ml）10μl/管 红色 HPV6,11阳性定量参考品（1.0×105基因拷贝/ml）10μl/管 黄色 HPV6,11阳性定量参考品（1.0×106基因拷贝/ml）10μl/管 蓝色 5.6 试剂储存条件：保存于—20℃，有效期6个月。 数量 2管 2管 1管 1管 1管 1管 1管 1管 1管 T HPV6,11阳性定量参考品（1.0×107基因拷贝/ml）10μl/管 绿色 1管 6 仪器
ABI 7500全自动基因扩增检测仪
7 操作步骤
7.1 DNA提取
7.1.1 阴性质控品处理
取出阴性质控品，8000rpm离心数秒，吸50μl至0.5ml灭菌离心管中，加入50μl DNA提取液充分混匀，100℃恒温处理10±1分钟；12000r/min离心5min，备用。
7.1.2 标本处理
7.1.2.1 泌尿生殖道分泌物棉拭子 a ) 向玻璃管中加入1 ml灭菌生理盐水，充分震荡摇匀，挤干棉拭子； b ) 吸取全部液体转至1.5ml离心管中，12,000rpm离心5分钟； c ) 去上清，沉淀加灭菌生理盐水1ml混匀，12,000rpm离心5分钟； d ) 去上清，沉淀中加入50μl DNA提取液充分混匀，100℃恒温处理10±1分钟； e ) 12,000 rpm离心5分钟，备用。 7.1.2.2 生殖道刮片 a ) 向有生殖道刮片的玻璃管中加入1 ml灭菌生理盐水，充分震荡摇匀； b ) 吸取全部液体转至1.5ml离心管中，12,000rpm离心5分钟； 以下处理同2.1.2.1：步骤a~e。 7.1.2.3 组织活检标本 a ) 用适量灭菌生理盐水清洗送检组织沾带的血液； b ) 取约50毫克组织，加1 ml灭菌生理盐水用匀浆器研磨成组织匀浆，转移至1.5ml离心管中，
12,000rpm 离心5分钟； c ) 去上清，沉淀中加入50μl DNA提取液充分混匀，100℃恒温处理10±1分钟； d ) 12,000 rpm离心5分钟，备用。
7.1.3 HPV6,11临界阳性质控品处理（同阴性质控品）； 7.1.4 HPV6,11强阳性质控品处理（同阴性质控品）；
7.1.5 HPV6,11阳性定量参考品处理：8000rpm离心数秒，备用； 7.2 PCR扩增
7.2.1 试剂准备（在试剂准备区操作）：按比例（HPV6,11 PCR反应液40μl/人份+ Taq酶3μl/人份）取相应量的PCR反应液及Taq酶，充分混匀后按43μl/管分装至0.2ml离心管中备用。
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7.2.2 加样：向准备好试剂的0.2ml离心管中，分别加入处理后的样品（包括样本、阴性质控品、临界阳性质控品和强阳性质控品）上清液2μl，或直接加入阳性定量参考品2μl，8000rpm离心数秒，放入仪器样品槽。
7.2.3 设置PCR循环扩增程序如下
93℃ 2分钟 预变性；
93℃ 45秒 → 55℃ 60秒 10个循环 93℃ 30秒 → 55℃ 45秒 30个循环
8 结果判断：
8.1.1 如果增长曲线不呈S型或Ct值=30，则判样品的HBV DNA总含量小于检测极限。 8.1.2 如果增长曲线呈S型曲线且Ct值<30，则按以下方法判断： a ) 若样品的C<5.00E+002，则样品的HPV6,11总含量<5.0×102基因拷贝/ml； b ) 若样品的5.00E+002≤C≤5.00E+008，则该样品的HPV6,11总含量=C基因拷贝/ml； c ) 若样品的C>5.00E+008，则样品的HPV6,11总含量>5.0×108 基因拷贝/ml，。如果需要精确
定量结果，可将提取后的样品稀释至线性范围内再检测。
9 质控
a ) 阴性质控品：增长曲线不呈S型曲线或Ct值=30； b ) 阳性质控品：增长曲线呈S型曲线，且强阳性质控品定量参考值在1.0×106基因拷贝/ml~2.0
×107基因拷贝/ml范围，临界阳性质控品定量参考值在2.0×102基因拷贝/ml~2.0×104基因拷贝/ml范围；（参考值为仪器自动分析计算出的数值）； c ) 阳性定量参考品：增长曲线呈S型，Ct值<27，且线性相关系数0.97≤|r|≤1； d ) 以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。
10 参考范围
低于检测下限
11 性能指标
灵敏度：5.0×102基因拷贝/ml
线性范围：5.0×102基因拷贝/ml~5.0×108基因拷贝/ml
12 临床意义
HPV是一组病毒的总称，组成一个科，其病毒形态类似，但DNA限制性内切酶图谱各异，核壳体蛋白质的抗原性不同。目前已经确定的HPV型别大约有80余种，依其感染的上皮所在部位分
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为皮肤型HPV和生殖道上皮HPV，大约35种型别可感染妇女生殖道，约20种与肿瘤相关。依据不同型别HPV与肿瘤发生的危险性高低分为低危险型别和高危险型别HPV，低危险型别HPV包括HPV6、11、42、43、44等型别，常引起外生殖器湿疣等良性病变包括宫颈上皮内低度病变（CIN I），高危险型HPV包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等型别，与宫颈癌及宫颈上皮内高度病变（CIN II/III）的发生相关，尤其是HPV16和18型。
13 注意事项
13.1 实验室管理应严格按照PCR基因扩增实验室的管理规范，实验人员必须进行专业培训，实验过程严格分区进行（试剂准备区、标本制备区、扩增和产物分析区），所用消耗品应灭菌后一次性使用，实验操作的每个阶段使用专用的仪器和设备，各区各阶段用品不能交叉使用；
13.2 为试剂和标本制备阶段提供生物安全柜，实验过程中穿工作服，带一次性手套，使用自卸管移液器；
13.3 对每次实验进行质量控制；
13.4 试剂使用前要完全解冻，但应避免反复冻融； 13.5 自备灭菌生理盐水；
13.6 标本处理时“去上清”步骤，注意吸头不要碰触沉淀；
13.7 试剂盒DNA提取液内含不溶于水的物质，取样时需用加样器充分混匀后吸取。如出现因吸头嘴部太细不能吸取或取样后堵塞吸头现象，可先用洁净无污染的剪刀将吸头嘴部剪去一截；
13.8 提取的DNA可于—20℃保存6个月；
13.9 标本制备区所用过的吸头请打入盛有消毒剂的容器，并与废弃物一起灭菌后方可丢弃； 13.10 实验完毕用10%次氯酸或75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；
13.11 所有检测样品应视为具有传染性物质，操作和处理均需符合相关法规要求：卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通用准则》和《医疗废物管理条例》。
14 参考文献
中华人民共和国卫生部医政司编．全国临床检验操作规程(第三版) ．南京：东南大学出版社，2006
中山大学达安基因股份有限公司.结核分支杆菌核酸检测试剂盒（PCR—荧光探针法）说明书.2009年7月，第一版/0 批准记录 批准人
批准时间 有效期 □1年；□其他： □1年；□其他： □1年；□其他： □1年；□其他： □1年；□其他： 第 31 页/共 93 页
解脲脲原体核酸定量检测标准操作程序 发布部门:XXXXX医院检验科 分发范围: 检验科PCR室 编写者: XX 审核者:XX 批准者:XXX 文件编号:PCR(N)-SOP-106 版本/修订号: A/0 实施日期: 2012年5月1日 1 项目名称
解脲脲原体核酸定量检测
2 检验方法名称
TaqMan荧光定量检测
3 方法学原理
用一对解脲脲原体特异性引物和一条解脲脲原体特异性荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团（R）和一个荧光淬灭基团（Q）。探针完整时，R基团发射的荧光信号被Q基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使R荧光基团和Q荧光基团分离，Q基团对R基团的抑制吸收作用消失，荧光监测系统就可接收到R基团的荧光信号。每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成。被切割产生的荧光分子数与PCR产物的数量成比例，这样就实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。因此根据PCR反应液的荧光强度即可计算出初始模板的数量。
4 标本要求
4.1 适用标本类型：生殖泌尿道分泌物等。 4.2 标本采集（泌尿生殖道分泌物） a ) 男性—用细小棉拭子伸入尿道约2～4 厘米，捻动拭子采集分泌物，将棉拭子置入无菌玻璃
管，密闭送检(采集分泌物前2小时禁小便) b ) 女性生殖道—用无菌生理盐水棉球洗去宫颈外分泌物，再用宫颈刷或无菌棉拭子插入宫颈
内，停5 秒钟后旋动宫颈刷或棉拭子采集宫颈分泌物，将宫颈刷或棉拭子置入无菌玻璃管，密闭送检。 c ) 女性尿道—用无菌生理盐水棉球洗净尿道口，再用无菌棉拭子插入尿道约2 厘米，捻动拭
子采集分泌物，将棉拭子置入无菌玻璃管，密闭送检。
4.3 标本保存：标本可立即用于测试，也可以保存于-20℃待测，保存期为6个月。
5 试剂
5.1 试剂名称：解脲脲原体核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光探针法） 5.2 生产厂家：中山大学达安基因股份有限公司； 5.3 试剂货号：#DA-B055； 5.4 包装规格：20人份/盒； 5.5 试剂成份： 组成部分 DNA提取液（500μl/管） UU PCR反应液（400μl/管） 第 32 页/共 93 页
数量 2管 2管
组成部分 Taq酶（60μl/管） UU阴性质控品（50μl/管） UU强阳性质控品（50μl/管） UU弱阳性质控品（50μl/管） UU阳性定量参考品（1.0×105基因拷贝/ml）10μl/管 红色 UU阳性定量参考品（1.0×106基因拷贝/ml）10μl/管 黄色 UU阳性定量参考品（1.0×107基因拷贝/ml）10μl/管 蓝色 UU阳性定量参考品（1.0×108基因拷贝/ml）10μl/管 绿色 5.6 试剂储存条件：保存于—20℃，有效期6个月。
数量 1管 1管 1管 1管 1管 1管 1管 1管 6 仪器
ABI 7500全自动基因扩增检测仪
7 操作步骤
7.1 DNA提取
7.1.1 阴性质控品处理 a ) 向阴性质控品管中加入等量DNA提取液充分混匀，100℃恒温处理10±1分钟； b ) 12000r/min离心5min，备用。 7.1.2 标本处理(生殖泌尿道分泌物) a ) 向玻璃管中加入1 ml灭菌生理盐水，充分震荡摇匀，挤干棉拭子； b ) 吸取全部液体转至1.5ml离心管中，12,000rpm离心5分钟； c ) 去上清，沉淀加灭菌生理盐水1ml混匀，12,000rpm离心5分钟； d ) 去上清，沉淀中加入50μl DNA提取液充分混匀，100℃恒温处理10±1分钟； e ) 12,000 rpm离心5分钟，备用。
7.1.3 UU弱阳性质控品处理（同阴性质控品）； 7.1.4 UU强阳性质控品处理（同阴性质控品）；
7.1.5 UU阳性定量参考品处理：8000rpm离心数秒，备用； 7.2 PCR扩增
7.2.1 试剂准备（在试剂准备区操作）：按比例（UU PCR反应液40μl/人份+ Taq酶3μl/人份）取相应量的PCR反应液及Taq酶，充分混匀后按43μl/管分装至0.2ml离心管中备用。
7.2.2 加样：向准备好试剂的0.2ml离心管中，分别加入处理后的样品（包括样本、阴性质控品、临界阳性质控品和强阳性质控品）上清液2μl，或直接加入阳性定量参考品2μl，8000rpm离心数秒，放入仪器样品槽。
7.2.3 设置PCR循环扩增程序如下
93℃ 2分钟 预变性；
93℃ 45秒 → 55℃ 60秒 10个循环 93℃ 30秒 → 55℃ 45秒 30个循环
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