结核分枝杆菌核酸检测标准操作程序 发布部门:XXXXXX医院检验科 分发范围: 检验科PCR室 编写者: 李佳 审核者:黄盛 批准者:李莉 文件编号:PCR(N)-SOP-104 版本/修订号: A/0 实施日期: 2012年5月1日 1 项目名称
结核分枝杆菌核酸定性检测
2 检验方法名称
TaqMan荧光定性检测
3 方法学原理
选用一对结核分枝杆菌特异性引物，同时加入一个特异性的、能与PCR产物杂交的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团（R）和一个荧光淬灭基团（Q）。探针完整时，R基团发射的荧光信号被Q基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使R荧光基团和Q荧光基团分离，Q基团对R基团的抑制吸收作用消失，荧光监测系统就可接收到R基团的荧光信号。每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成。被切割产生的荧光分子数与PCR产物的数量成比例，这样就实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。因此根据PCR反应液的荧光强度即可计算出初始模板的数量。
4 标本要求
4.1 适用标本类型：痰液、肺及支气管灌洗液、尿液。
4.2 痰液：清晨从肺深部咳出的痰液，用无菌5ml玻璃管收集1~3ml，密闭送检； 4.3 肺及支气管灌洗液：用无菌5ml玻璃管收集灌洗液1~3ml，密闭送检； 4.4 尿液：用无菌5ml玻璃管收集中段尿1~3ml，密闭送检。
4.5 标本保存：标本可立即用于测试，也可以保存于-20℃待测，保存期为6个月。
5 试剂
5.1 试剂名称：结核分枝杆菌核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法） 5.2 生产厂家：中山大学达安基因股份有限公司； 5.3 试剂货号：#DA-B052； 5.4 包装规格：20人份/盒； 5.5 试剂成份： 组成部分 DNA提取液（500μl/管） TB PCR反应液（400μl/管） Taq酶（60μl/管） TB阴性质控品（250μl/管） TB强阳性质控品（200μl/管） TB临界阳性质控品（200μl/管） TB阳性定量参考品（1.0×104IU/ml）10μl/管 红色 第 24 页/共 93 页
数量 2管 2管 1管 1管 1管 1管 1管
组成部分 TB阳性定量参考品（1.0×105IU/ml）10μl/管 黄色 TB阳性定量参考品（1.0×106IU/ml）10μl/管 蓝色 TB阳性定量参考品（1.0×107IU/ml）10μl/管 绿色 5.6 试剂储存条件：保存于—20℃，有效期6个月。
数量 1管 1管 1管 6 仪器
ABI 7500全自动基因扩增检测仪
7 操作步骤
7.1 DNA提取
7.1.1 阴性质控品处理
取出阴性质控品，8000rpm离心数秒，吸50μl至0.5ml灭菌离心管中，加入50μl DNA提取液充分混匀，100℃恒温处理10±1分钟；12000r/min离心5min，备用。
7.1.2 标本处理 7.1.2.1 痰液 a ) 向玻璃管中加入4倍体积4%NaOH，摇匀，室温下放置15~30分钟左右液化； b ) 取1ml液化后标本至1.5ml离心管中，12000rpm离心5分钟； c ) 弃上清，沉淀加无菌生理盐水1ml混匀。12000rpm离心5分钟； d ) 弃上清，沉淀加无菌生理盐水1ml混匀。12000rpm离心5分钟； e ) 弃上清。沉淀中加50μlDNA提取液充分混匀。100℃干式恒温浴10±1分钟； f ) 12000r/min离心5min，备用。 7.1.2.2 肺及支气管灌洗液 a ) 取灌洗液1ml至1.5ml离心管中，12000rpm离心5分钟； b ) 弃上清，沉淀加无菌生理盐水1ml混匀。12000rpm离心5分钟； c ) 弃上清。沉淀中加50μlDNA提取液充分混匀。100℃干式恒温浴10±1分钟； d ) 12000r/min离心5min，备用。 7.1.2.3 尿液 a ) 摇匀尿液，取1ml至1.5ml离心管中，12000rpm离心5分钟； b ) 弃上清，沉淀加无菌生理盐水1ml混匀。12000rpm离心5分钟； c ) 弃上清。沉淀中加50μlDNA提取液充分混匀。100℃干式恒温浴10±1分钟； d ) 12000r/min离心5min，备用。
7.1.3 TB临界阳性质控品处理（同阴性质控品）； 7.1.4 TB强阳性质控品处理（同阴性质控品）；
7.1.5 TB阳性定量参考品处理：8000rpm离心数秒，备用； 7.2 PCR扩增
7.2.1 试剂准备（在试剂准备区操作）：按比例（TB PCR反应液40μl/人份+ Taq酶3μl/人份）取相应量的PCR反应液及Taq酶，充分混匀后按43μl/管分装至0.2ml离心管中备用。
7.2.2 加样：向准备好试剂的0.2ml离心管中，分别加入处理后的样品（包括样本、阴性质控品、临界阳性质控品和强阳性质控品）上清液2μl，或直接加入阳性定量参考品2μl，8000rpm离心数秒，放入仪器样品槽。
7.2.3 设置PCR循环扩增程序如下
93℃ 2分钟 预变性；
93℃ 45秒 → 55℃ 60秒 10个循环 93℃ 30秒 → 55℃ 45秒 30个循环
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8 结果判断：
8.1.1 如果增长曲线不呈S型或Ct值=30，则判样品的HBV DNA总含量小于检测极限。 8.1.2 如果增长曲线呈S型曲线且Ct值<30，则按以下方法判断： a ) 若样品的C<5.00E+002，灌洗液、尿液样品的TB DNA总含量<5.0×102基因拷贝/ml，痰液
的TB DNA总含量<2.5×103基因拷贝/ml b ) 若样品的5.00E+002≤C≤5.00E+008，则灌洗液、尿液样品的TB DNA总含量=C基因拷贝
/ml，痰液的TB DNA总含量=5.0×C基因拷贝/ml； c ) 若样品的C>5.00E+008，则灌洗液、尿液样品的TB DNA总含量>5.0×108 基因拷贝/ml，
痰液的TB DNA总含量>2.5×109 基因拷贝/ml。如果需要精确定量结果，可将提取后的样品稀释至线性范围内再检测；
9 质控
d ) 阴性质控品：增长曲线不呈S型曲线或Ct值=30； e ) 阳性质控品：增长曲线呈S型曲线，且强阳性质控品定量参考值在1.0×105基因拷贝/ml~2.0
×106基因拷贝/ml范围，弱阳性质控品定量参考值在1.0×103基因拷贝/ml~2.0×104基因拷贝/ml范围；（参考值为仪器自动分析计算出的数值）；
f ) 阳性定量参考品：全部阳性，Ct值<27，且线性相关系数0.97≤|r|≤1； g ) 以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。
10 参考范围
低于检测下限
11 性能指标
灵敏度：5.0×102基因拷贝/ml
线性范围：5.0×102基因拷贝/ml~5.0×108基因拷贝/ml
12 临床意义
结核杆菌为难培养的微生物，PCR方法对结核杆菌感染的快速检测有重要应用价 12.1 结核杆菌感染的快速诊断
结核杆菌因其培养周期长，临床很难采用培养方法进行结核杆菌感染的快速检测，而采用PCR方法，则可以做到这一点。如通过对痰、血液、淋巴液、脑脊液、胸腹水等标本中结核杆菌的PCR检测，快速诊断肺结核、结核杆菌菌血症、淋巴结核、结核性脑膜炎、结核性胸腹膜炎等。
12.2 抗结核治疗的监测
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在抗结核治疗中，采用PCR方法定期检测，可评价抗结核药物的疗效。
13 注意事项
13.1 实验室管理应严格按照PCR基因扩增实验室的管理规范，实验人员必须进行专业培训，实验过程严格分区进行（试剂准备区、标本制备区、扩增和产物分析区），所用消耗品应灭菌后一次性使用，实验操作的每个阶段使用专用的仪器和设备，各区各阶段用品不能交叉使用；
13.2 为试剂和标本制备阶段提供生物安全柜，实验过程中穿工作服，带一次性手套，使用自卸管移液器；
13.3 对每次实验进行质量控制；
13.4 试剂使用前要完全解冻，但应避免反复冻融； 13.5 自备灭菌生理盐水；
13.6 标本处理时“去上清”步骤，注意吸头不要碰触沉淀；
13.7 试剂盒DNA提取液内含不溶于水的物质，取样时需用加样器充分混匀后吸取。如出现因吸头嘴部太细不能吸取或取样后堵塞吸头现象，可先用洁净无污染的剪刀将吸头嘴部剪去一截；
13.8 提取的DNA可于—20℃保存6个月；
13.9 标本制备区所用过的吸头请打入盛有消毒剂的容器，并与废弃物一起灭菌后方可丢弃； 13.10 实验完毕用10%次氯酸或75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；
13.11 所有检测样品应视为具有传染性物质，操作和处理均需符合相关法规要求：卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通用准则》和《医疗废物管理条例》。
14 参考文献
中华人民共和国卫生部医政司编．全国临床检验操作规程(第三版) ．南京：东南大学出版社，2006
中山大学达安基因股份有限公司.结核分支杆菌核酸检测试剂盒（PCR—荧光探针法）说明书.2009年7月，第一版/0 批准记录 批准人
批准时间 有效期 □1年；□其他： □1年；□其他： □1年；□其他： □1年；□其他： □1年；□其他： 第 27 页/共 93 页
人乳头瘤病毒（6,11型）核酸检测标准操作程序 发布部门:XXXXXX医院检验科 分发范围: 检验科PCR室 编写者: XXX 审核者:XXX 批准者:XXXX 文件编号:PCR(N)-SOP-105 版本/修订号: A/0 实施日期: 2012年5月1日 1 项目名称
人乳头瘤病毒（6,11型）核酸检测
2 检验方法名称
TaqMan荧光定量检测
3 方法学原理
选用人乳头瘤病毒（HPV）6型（GenBank序列号为：AF092932）基因组中编码主要外壳蛋白L1基因编码区为扩增靶区域，设计一对针对该区域的特异性引物，同时加入一个特异性的、能与PCR产物杂交的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团（R）和一个荧光淬灭基团（Q）。探针完整时，R基团发射的荧光信号被Q基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使R荧光基团和Q荧光基团分离，Q基团对R基团的抑制吸收作用消失，荧光监测系统就可接收到R基团的荧光信号。每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成。被切割产生的荧光分子数与PCR产物的数量成比例，这样就实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。因此根据PCR反应液的荧光强度即可计算出初始模板的数量。
4 标本要求
4.1 适用标本类型：泌尿生殖道分泌物棉拭子、生殖道刮片、组织活检标本等。 4.2 标本采集
4.2.1 泌尿生殖道分泌物棉拭子 a ) 男性—用细小棉拭子伸入尿道约2～4 厘米，捻动拭子采集分泌物，将棉拭子置入无菌玻璃
管，密闭送检(采集分泌物前2小时禁小便) b ) 女性生殖道—用无菌生理盐水棉球洗去宫颈外分泌物，再用宫颈刷或无菌棉拭子插入宫颈
内，停5 秒钟后旋动宫颈刷或棉拭子采集宫颈分泌物，将宫颈刷或棉拭子置入无菌玻璃管，密闭送检。 c ) 女性尿道—用无菌生理盐水棉球洗净尿道口，再用无菌棉拭子插入尿道约2 厘米，捻动拭
子采集分泌物，将棉拭子置入无菌玻璃管，密闭送检。
4.2.2 生殖道刮片：用刮片刮取宫颈病灶处脱落细胞,置入无菌玻璃管，密闭送检。
4.2.1 组织活检标本（包括宫颈组织、外阴组织、尖锐湿疣疣状组织等）：取可疑组织适量置无菌玻璃管，密闭送检。
4.3 标本保存：标本可立即用于测试，也可以保存于-20℃待测，保存期为6个月。
5 试剂
5.1 试剂名称：人乳头瘤病毒（6,11型）核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法） 5.2 生产厂家：中山大学达安基因股份有限公司； 5.3 试剂货号：#DA-B056； 5.4 包装规格：20人份/盒；
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