分子诊断学习题 LucasGu
[本题答案] A
12.总RNA经琼脂糖凝胶电泳EB染色后观察不到的是 A mRNA B 28SrRNA C 18SrRNA D 5SrRNA E 5.8SrRNA [本题答案] A
13. 以下哪项有利于DNA的保存 A 溶于TE中DNA在室温可储存数年 B 加入少量DNase C 溶于pH 3.0溶液
D 加入少量DNase和RNase
E 在DNA样品中加入少量氯仿，可有效避免细菌污染 [本题答案] E
14. 酚抽提法可用于高分子量DNA的分离纯化，所用试剂分别有不同的功能，下列正确的是
A SDS为 阳离子去污剂，主要引起细胞膜的降解并能乳化脂质和蛋白质
B EDTA为二价金属离子螯合剂，可促进DNase的活性 C 蛋白酶K只可消化K类蛋白质 D 酚可使蛋白质变性沉淀
E 无RNase的DNase可有效地水解RNA [本题答案] C
15. 下列哪种不是对核酸分子完整性进行鉴定的方法 A 凝胶电泳法 B Northern杂交 C ELISA
D Western blotting E 生物芯片技术 [本题答案] D
16. 下列哪种方法不是分离纯化高分子量DNA的 A 酚抽提法 B 煮沸裂解法 C 甲酰胺解聚法 D 玻棒缠绕法 E 异丙醇沉淀法 [本题答案] B
17. 下列哪种不是从琼脂糖凝胶中回收DNA片段的方法 A DEAE纤维素膜插片电泳法 B 电泳洗脱法 C 冷冻挤压法
D 低熔点琼脂糖挖块回收法 E 漂洗法 [本题答案] E
18.适合从琼脂糖凝胶中回收5kb的DNA片段的方法是 A DEAE纤维素膜插片电泳法 B 非透析袋电泳洗脱法 C透析袋电泳洗脱法 D 压碎与浸泡法 E 冷冻挤压法 [本题答案] C
19.适合从琼脂糖凝胶中回收500bp~5kb的DNA片段的方法是A DEAE纤维素膜插片电泳法 B 非透析袋电泳洗脱法 C透析袋电泳洗脱法 D 压碎与浸泡法 E 冷冻挤压法 [本题答案] A
20.适合从聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA片段的标准方法是 A DEAE纤维素膜插片电泳法 B 非透析袋电泳洗脱法 C透析袋电泳洗脱法 D 压碎与浸泡法 E 冷冻挤压法 [本题答案] D
21. 大多数质粒的结构特点一般为 A 单链线性DNA B 双链线性DNA C 闭合环状单链DNA D 闭合环状双链DNA E DNA-RNA杂交体 [本题答案] D
22. 目前使用较为广泛的质粒DNA小量提取的方法是 A牙签少量制备法 B 小量一步提取法 C SDS裂解法 D 碱裂解法 E 煮沸裂解法 [本题答案] D
23. 有关煮沸裂解法提取质粒DNA的正确叙述是 A 该法是一种条件比较温和的物理方法 B 煮沸能完全灭活核酸内酶A C 不适用于大多数E.coli菌株
分子诊断学习题 LucasGu
D 适用于HB101菌株
E 适用于<15kb的质粒DNA制备 [本题答案] E
24. CsCl2-EB法中在过量EB存在的下，超速离心后密度最大沉于管底的是 A 蛋白质
B 带切口的环状或线性DNA C RNA D 复合糖类 E 闭环质粒DNA [本题答案] C
25. 用柱层析法纯化质粒DNA时DNA的何种残基与硅基质结合 A 嘌呤 B 磷酸盐残基 C 嘧啶 D 糖基 E 氢离子 [本题答案] B
26. 在RNA纯化时，常使用的水饱和酚的pH值为 A 3.5-4.0 B 4.5-5.5 C 6.0-7.5 D 7.0-8.5 E 9.0-10.0 [本题答案] B
27. 分离与纯化mRNA可采用下列哪种方法 A oligo(dT)-纤维素柱层析法 B oligo(dA)-纤维素液相结合离心法 C oligo(U)-滤纸法
D oligo(dC)-纤维素柱层析法 E oligo(dG)-纤维素液相结合离心法 [本题答案] A
名词解释
1.RNA酶蛋白抑制剂
[本题答案] RNA酶蛋白抑制剂（RNasin）是从人胎盘分离的一种蛋白质可与多种RNA酶紧密结合形成非共价结合的等摩尔复合物，使RNA酶失活。
2.电泳洗脱法
[本题答案] 电泳洗脱法是将待回收的DNA片段电泳出凝胶介质，使其进入一个便于回收的固定的小容积溶液中；再通过一些方法分离纯化出DNA片段。目前主要有透析袋电泳洗脱法与非透析
袋电泳洗脱法两大类。
3.A260/A280
[本题答案]指核酸溶液在260nm和280nm紫外波长下的吸光度的比值，根据比值来判断核酸样品有无蛋白质和酚等的污染。 问答题
1. 在核酸的分离和纯化过程中，如何保持核酸的完整性？ [本题答案] 为了保证核酸的完整性，首先在操作过程中，应尽量简化操作步骤，减少各种破坏核酸的有害因素，包括物理、化学与生物学的因素。提取应在0～4℃的条件下进行；另外避免强力的机械剪切力对核酸的破坏。细胞内或外来的核酸酶对核酸的生物降解，而破坏核酸的一级结构，使用EDTA、柠檬酸盐并在低温条件下操作，基本上就可以抑制DNA酶的活性；并尽可能地抑制RNA酶的活性。
2. 试述举2种质粒DNA提取的方法及应用。
[答案] 质粒DNA提取的方法包括碱裂解法、煮沸裂解法和SDS裂解法。
1）碱裂解法：在NaOH存在的强碱性（pH12.0～14.0）的条件下，用强阳离子去垢剂SDS破坏细胞壁和裂解细胞，并使宿主细胞的蛋白质与染色体DNA发生变性，释放出质粒DNA。它是一种适用范围很广的方法，能从所有的大肠杆菌（E.coli）菌株中分离出质粒DNA，制备量可大可小。
2）煮沸裂解法：是将细菌悬浮于含Triton X-100和溶菌酶的缓冲液中，Triton X-100和溶菌酶能破坏细胞壁，再用沸水浴裂解细胞，使宿主细胞的蛋白质与染色体DNA发生变性。对CCC质粒DNA因结构紧密不会解链，当温度下降后，CCC质粒DNA可重新回复其超螺旋结构，通过离心去除变性的蛋白质和染色体DNA，然后回收上清液中的质粒DNA。本法只能用于小质粒DNA（小于15kb）的小量或大量制备，适用于大多数从大肠杆菌（E.coli）菌株中分离出质粒DNA。
3）SDS裂解法：它是将细菌悬浮于等渗的蔗糖溶液中，用溶菌酶和EDTA处理以破坏细胞壁，再用SDS裂解去壁细菌，从而温和地释放出质粒DNA到等渗溶液中，然后用酚/氯仿抽提。适用于大质粒DNA的提取。
3. 简述哺乳动物细胞基因组DNA抽提的主要方法有哪几种？ [本题答案]哺乳动物细胞基因组DNA抽提的主要方法有： 酚提取法、甲酰胺解聚法 、玻棒缠绕法和异丙醇沉淀法、磁珠吸附法等。
4. 简述从琼脂糖凝胶中回收DNA片段的主要方法有哪几种？ [本题答案] 从琼脂糖凝胶中回收DNA片段的方法主要包括 DEAE-纤维素膜插片电泳法、电泳洗脱法、低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法、冷冻挤压法及现在有试剂盒供应的以硅为基础的纯化系统等。
分子诊断学习题 LucasGu
5.简述磁性球珠分离法分离mRNA的原理。
[本题答案]磁性球珠分离法是基于寡聚(dT)与poly(A)的互补配对特性、用生物素标记寡聚(dT)，通过寡聚(dT)与mRNA 3’端poly(A)形成杂交体，这种杂交非常迅速，在1－2分钟内就可完成，可有效地除去rRNA,tRNA以及其他RNA,而后通过生物素与链亲和素顺磁性磁珠之间的相互作用来捕获这些杂交物而达到分离纯化。
重组DNA技术
一、选择题
1、下列有关重组DNA技术的叙述，正确的是（ ） A．重组DNA技术所用的工具酶是限制酶、连接酶和运载体 B．所有的限制酶都只能识别一种特定的核苷酸序列 C．选细菌作为重组质粒的受体细胞是因为细菌繁殖快 D．只要目的基因进入了受体细胞就能成功实现表达
2、下列不属于获取目的基因的方法是（ ） A．“鸟枪法” B．转录法 C．反转录法
D．根据已知氨基酸序列合成法
3、作为基因的运输工具-运载体，必须具备的条件之一及理由是（ ）
A．能够在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便提供大量的目的基因
B．具有多个限制酶切点，以便于目的基因的表达 C．具有某些标记基因，以便为目的基因的表达提供条件 D．能够在宿主细胞中复制并稳定保存，以便于进行筛选
4、基因治疗是把健康的外源基因导入（ ） A．有基因缺陷的DNA分子中 B．有基因缺陷的染色体中 C．有基因缺陷的细胞器中 D．有基因缺陷的细胞中
5、应用重组DNA技术诊断疾病的过程中必须使用基因探针才能达到检测疾病的目的。这里的基因探针是指（ ） A．用于检测疾病的医疗器械
B．用放射性同位素或荧光分子等标记的DNA分子 C．合成β-球蛋白的DNA D．合成苯丙羟化酶的DNA片段
6、基因工程的操作步骤：①使目的基因与运载体结合②将目的
三、问答题
1、质粒为细菌染色体外一些双链、共价闭合环状DNA分子，是能够进行独立复制并保持稳定遗传的复制子。质粒具有复制和控制机构，能够在细胞质中独立自主的进行自身复制，并使子代细胞保持它们恒定的拷贝数。
质粒一般具有以下特性：①自主复制性，它能独立于宿主细胞的染色体DNA而自主复制；②质粒不相容性；③可扩增性；④可转移性。 三、问答题
1、 简述质粒的概念和特性，常用的质粒载体有哪几种？ 2、 简述重组DNA技术的原理及技术。 3、 简述黏性末端DNA重组体的构建过程。 4、 举例说出重组DNA技术在医药领域的应用。 答案 一、选择题
1．B 2．B 3．A 4．A 5．B 6．C 二、名词解释
1、限制性核酸内切酶简称限制酶，是一类能识别双链DNA分子中某特定的核苷酸序列，并在识别序列内或附近切割DNA双链结构的核酸内切酶。它是一类专一性很强的核酸内切酶，在基因的分离、DNA结构的分析、载体的改造以及体外重组中均有重要作用。
2、是指能携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的一类DNA分子。载体按照基本组成元件的来源不同，可分为质粒载体、噬菌体载体、噬菌粒载体、粘粒载体、人工染色体载体等。按功能可分为克隆载体和表达载体。
3、黏粒又称柯斯质粒，是一种λ噬菌体以为基础，专门为克隆大片段而设计并和质粒共同构建的杂合载体。它由λ噬菌体DNA的cos位点序列和质粒的复制子构建而成。
5、 把带有目的基因的重组质粒DNA引入受体细胞的过程成为
转化。
6、 将重组噬菌体DNA直接引入受体细胞的过程则称为转染。 7、 若重组噬菌体DNA被包装到噬菌体头部成为有感染力的噬
菌体颗粒，再以此噬菌体为运载体，将头部重组DNA导入受体细胞中，这一过程成为转导，通常成为感染。 C．④①②③ D．③④①②
二、名词解释
1、 限制性核酸内切酶 2、载体 3、黏粒 4、转化 5、转染 6、
转导
基因导入受体细胞③检测目的基因的表达④提取目的基因。正确
理想质粒载体应具备①具有松弛型复制子；②在复制子外存在
的顺序是（ ） 几个单一的酶切位点；③具有插入失活的筛选标记；④分子量相对A．③②④① B．②④①③
较小，有较高的拷贝数。
常见的质粒载体有：pBR322质粒、pUC质粒载体、pGEM
分子诊断学习题 LucasGu
系列载体等。
2、重组DNA是在体外利用限制性内切酶，将不同来源的DNA分子进行特异的切割，获得的目的基因或DNA片段与载体连接，从而组成一个新的DNA分子。重组的DNA分子能够通过一定的方式进入相应的宿主细胞，并在宿主细胞中进行无性繁殖，获得大量的目的基因或DNA片段。经重组的DNA分子能在宿主细胞中进行表达，获得相应的蛋白质。
大致步骤包括：①目的基因的获取；②载体的选择；③目的基因与运载体连接成重组 DNA；④重组DNA导入受种细胞；⑤重组体的筛选。
3、目的基因和载体可由同一种限制酶切割后产生，或由不同的限制酶切割形成互补黏性末端，经退火，彼此间很容易按碱基配对原则形成氢键。然后由DNA连接酶催化连接接头处的缺口，形成重组质粒。载体DNA在限制酶切割后，用碱性磷酸酶处理，除去5’端磷酸基，以避免载体DNA自身环化。
4、可以利用重组DNA技术探明致病基因的结构和功能，了解其致病机制；开发基因工程药物和疫苗用于临床；建立基因诊断、治疗技术，为疾病的预防、治疗提供新方法、新技术。具体可用于基因诊断：基因诊断是从基因水平上检测人类遗传性疾病的基因缺陷；基因治疗：是指将人的正常基因或有治疗作用的基因通过载体导入人体靶细胞取代靶细胞中的缺陷基因，从而达到治疗疾病目的的方法；基因工程药物、疫苗和抗体的研究和制备；利用基因敲除或转基因技术可改造生物、培育新的生物品种或用于药物筛选和新药评价等。
临床基因扩增检验技术
一、A型选择题
1．下列哪种不是基因扩增检验技术（D） A．PCR B．LCR C．NASBA D．bDNA E．SDA
2．以下基因扩增检验技术中，哪一种属于等温扩增（E） A．PCR B．RT-PCR C．LCR D．Hybrid capture E．NASBA
3．能使扩增灵敏度提高的方法是（B）
A．多重PCR B．巢式PCR C．原位PCR D．反向PCR E．不对称PCR
4．能对未知序列进行扩增的PCR是（D）
A．多重PCR B．巢式PCR C．原位PCR D．反向PCR E．不对称PCR
5．在定量PCR中，对原始模板准确定量的影响因素中，最大的是（B）
A．原始模板的量 B．扩增效率 C．循环次数 D．扩增产物的量 E．循环阈值 6．外标定量方法最大的缺点是（B）
A．不能测定原始模板的绝对量 B．测定的重复性和精密性有问题
C．标准品制备困难 D．不能排除样本间的测定差异
E．测定必须在扩增的指数期进行 7．最早推出的荧光定量探针是（A）
A．TaqMan探针 B．相邻探针 C．分子信标 D．阴阳探针 E．端粒探针
8．PCR测定中的污染主要是指（D）
A．标本间的交叉法治 B．环境中的细菌污染 C．灰尘污染
D．PCR扩增产物的污染 E．试剂中的污染物 9．UNG防污染预防下列哪种污染（A）
A．产物 B．靶核酸 C．气溶胶 D．标本间 E．病原微生物
10．TaqMan探针采用的是（A）
A．荧光标记的探针 B．生物素标记的探针 C．同位素标记的探针
D．SYBR Green标记引物 E．圆形探针 X型题选择题
1．DNA聚合酶要求下述哪些物质才能进行DNA复制（ABCD）
A．dDNA B．Mg2+C．引物 D．模板 E．小牛血清白蛋白
2．核酸扩增抑制物的主要来源是（ABCE）
A．血清中的血红素 B．尿标本是的尿素 C．核酸提取中的有机溶剂
D．Mg2+ E．部分抗凝剂
3．临床基因扩增中，弱阳性室内质控样本发生失控，其原因可能是（ABDE）
A．核酸提取中的丢失 B．标本中扩增抑制物残留 C．扩增仪孔间温度不均一
D．Taq酶和/或逆转录酶失后 E．扩增产物污染 二、名词解释 1．聚合酶链反应 2．原位PCR 3．RT-PCR 4．反向PCR 5．多重PCR 6．巢式PCR 7．不对称PCR 8．锚定PCR 9．荧光定量PCR 10．循环阈值 11．TaqMan探针 12．分子信标 13．LCR 三、问答题
1．影响PCR反应的因素有哪些？
2．试证明Ct值与模板DNA的起始拷贝数成反比。 3．简述bDNA信号放大系统的原理。 4．PCR检测技术有何临床应用。
分子诊断学习题 LucasGu
5．临床基因扩增检验实验室应如何设置。 6．如何保证临床基因扩增检验实验室的质量。
参考答案
一、A型选择题 5．B 9．荧光定量PCR：荧光定量PCR亦称实时荧光PCR是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号检测整个PCR过程，获得在线描述PCR过程的动力学曲线，最后通过标准曲线对未知模板核酸进行定量分析的方法。
10．循环阈值：循环阈值是在PCR扩增过程中，荧光信号模板DNA的起始拷贝数成反比。
1．D 2．E 3．B 4．D 开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。 Ct值与6．B 7．A 8．D 9．A 11．TaqMan探针：在TaqMan探针法的定量PCR反应体
10．A
X型题：
1．ABCD 2．ABCE 3．ABDE 二、名词解释
1．聚合酶链反应：PCR是利用DNA聚合酶（如Taq DNA聚合酶）等在体外条件下，催化一对引物间的特异DNA片断合成的基因体外扩增技术。由变性－退火－延伸三个基本反应步骤构成。
2．原位PCR：是指直接用细胞涂片或石蜡片包埋组织切片在单个细胞中进行PCR扩增，然后用特异探针进行原位杂交检测含该特异序列的细胞的一种方法。
3．RT-PCR：逆转录PCR是一种检测RNA的方法。其原理是先在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板合成互补的cDNA，再以此cDNA为模板进行PCR反应。
4．反向PCR：是对已知DNA片断两侧的未知序列进行扩增和研究的一种方法。其原理是：用限制性内切酶消化DNA片断，然后用连接酶将酶切产物连接成环状，再用已知序列上两端相反方向的引物进行PCR。
5．多重PCR：是在一次反应中加入多种引物，同时扩增一份DNA样品中的不同序列。每对引物所扩增的产物序列长短不一。根据不同长短的序列存在与否，检测是否有某些基因片断的缺失与突变。多重PCR对于检测疾病相关基因十分庞大的疾病很有价值。
6．巢式PCR：巢式PCR有两对引物，一对引物对应的序列在模板外测，称外引物，另一对引物互补序列在同一模板的外引物的内侧，称内引物，即外引物扩增产物较长，含有内引物扩增的靶序列，经过二次PCR放大将单拷贝的目的DNA序列检出。巢式PCR最大的优点是灵敏度大大提高
7．不对称PCR：不对称PCR的目的是扩增产生特异长度的单链DNA。PCR反应中采用两种不同浓度的引物，一般采用50～100：1比例，最初的10～15个循环中主要产物还是双链DNA，但当低浓度的引物被消耗尽后，以后的循环只产生高浓度引物的延伸产物，结果产生大量单链DNA。因PCR反应中使用二种引物浓度不同，因此称为不对称PCR。
8．锚定PCR：锚定主要用于扩增未知序列或未全知的序列。首先分离总RNA或mRNA，在逆转录酶作用下合成cDNA，通过DNA末端转移酶在cDNA的3′端上加上poly(dG)尾，与此poly(dG)相对应的锚定引物为poly(dC)，为保证扩增特异性，poly(dC)应在十二聚以上，5′端还可带上某些限制性酶序列或其他序列信息。
系中，包括一对引物和一条探针。探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有荧光报告基团，如FAM、VIC等，3′端标有荧光淬灭基团，如TAMRA等。当探针完整时，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其3′→5′外切酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收从而产生荧光信号。所以，每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程，荧光信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。
12．分子信标：分子信标探针是TaqMan探针的一种衍生方法。探针设计与TaqMan探针相似，只不过是探针5′和3′端的一小段核苷酸序列被设计成互补的，没有与靶序列杂交时会形成发夹状态，此时荧光基团和淬灭基团极端靠近，荧光几乎完全淬灭。探针与靶序列杂交后，发夹展开，荧光基团与淬灭基团分开，荧光得以恢复，荧光检测系统即可接收到荧光基团的荧光信号
13．LCR：连接酶链反应又称为连接酶扩增反应。LCR是以DNA连接酶将某一DNA链的5′磷酸与另一相邻链的3′羟基连接为基础的循环反应。LCR扩增对象不是目标片段，而是由引物组成的探针，是一种探针扩增技术。LCR需要两对引物A、B和A′、B′，其中引物A与引物A′互补，引物B与引物B′互补。模板双链DNA经加热变性后，两对引物分别与模板链复性退火，复性后引物A和B′的3′端分别与引物B和A′的5′端相邻。若引物与模板完全互补，在DNA连接酶的作用下，使得相邻两个引物A和B、A′和B′的5′磷酸与3′羟基形成磷酸二酯键而相连。连接产物变性后，又可作为引物的模板参加反应，使扩增呈指数增长，经过变性-复性（退火）-连接的20～30个循环，检测连接反应的产物。
三、问答题
1．影响PCR反应的因素有哪些？
PCR反应体系包含DNA模板、寡核苷酸引物、DNA聚合酶、dNTP及含有必需离子的反应缓冲液，这些因素都对PCR反应产生影响。
2．试证明Ct值与模板DNA的起始拷贝数成反比。 一般来说，第n次PCR循环的荧光信号强度（Rn）等于背景信号强度（RB）加上每个分子的荧光强度（即单位荧光强度RS与分子数目的乘积），用数学式表示如下：
Rn = RB +XO（1+Ex）nRs