分子诊断学习题 LucasGu
式中：Rn代表荧光信号强度
RB代表背景信号强度 Xo代表起始模板拷贝数 Ex代表扩增效率 Rs代表单位荧光强度 N代表循环次数 当循环次数n=Ct时，则
RT=RB+Xo（1+Ex）CtRs
两边取对数，则
lg（RT-RB）=lgXo+Ct lg（1+Ex）+lgRs
将其整理，则，
lgXo lg(RT-RB)-lgRs 应混合物配制和扩增区以及扩增产物分析区。如果采用全自动扩增仪，后两个区域可以合并。应注意的是，各工作区域必须有明确的标记，避免不同工作区域内的设备、物品混用。进入各工作区域必须严格按单一方向进行，即试剂贮存和准备区→标本制备区→扩增反应混合物配制和扩增区→扩增产物分析区。各区的仪器设备包括工作服、鞋子、实验记录本和笔等都必须专用，不得混淆。此外，上述四个工作区域内还应有固定于房顶的紫外灯，以便于工作后区域内的空气照射。
6．如何保证临床基因扩增检验实验室的质量。
临床基因扩增检验实验室的常规测定由一系列步骤组成，包括样本收集、样本处理（核酸提取）、核酸扩增、产物检测结果报告及解释等。室内质量控制仅涉及样本处理、核酸扩增和产物分析等测定分析步骤，而室间质量评价则除了监测测定分析步骤外，还包括较大范围的实验室活动，诸如样本接收中的可靠性、结果报告及解释等。QA则是覆盖更广范围的活动，包括样本收集、结果报告和解释等。
Ct= + lg(1+Ex) lg(1+Ex)
对每一个特定的PCR反应来说,Ex、RT、RB、和Rs都是常数，所发Ct值与lgXo成反比，也就是说，Ct值与起始模板DNA的拷贝数（Xo）的对数成反比，起始DNA浓度每增一倍，Ct值减小一个循环。因此，Ct值的引入确保了实时荧光PCR定量的精确和严格。
3．简述bDNA信号放大系统的原理。
分枝DNA是人工合成的带有侧链的DNA片段，在每个侧链上都可以标记可被激发的标记物。以bDNA为基础建立的连续放大DNA信号以检测DNA的技术称为分枝DNA信号放大系统。
bDNA信号放大系统包括四种杂交探针，即目标探针、前放大体、 放大体和标记探针。首先用亲和素包被微孔，加入目标探针，该组探针能与等检核酸靶序列上不同区域互补，其5′端用生物素标记，能与微孔中的亲和素高度亲和结合；再向微孔中加入待测标本，目标核酸与固定于微孔中的目标探针结合；再加入前放大体，该组探针的一段能与目标核酸的不同区域互补结合，另一段与放大体（即分枝DNA）的主链部分的序列互补结合，分枝DNA由主链和数十根寡核苷酸组成，每个分枝上都有标记探针的杂交位点，由酶标寡核苷酸组成的标记探针与bDNA上的互补序列结合，加入底物后最后经化学发光检测仪检测。利用bDNA信号放大系统可在每个靶序列上结合60～300个酶分子，而且所有杂交反应同时进行，观察到的信号与靶DNA的量成正比，可通过标准曲线将靶DNA定量。
4．PCR检测技术有何临床应用。
（1）PCR在病原微生物的检测中的应用；（2）PCR在遗传病中的应用；（3）PCR在肿瘤中的应用；（4）其它方面的应用：PCR技术除用于临床诊断和治疗外，还可用于DNA指纹、个体识别、亲子关系识别、法医物证等。
5．临床基因扩增检验实验室应如何设置。
由于基因扩增检验是对靶核酸的指数倍扩增过程，因而有大量的扩增产物的出现，这种扩增产物极易对以后的新扩增反应产生“污染”，为防止这种污染的发生，就需要对基因扩增检验实验室进行严格的分区。临床基因扩增检验实验室原则上分为四个分隔开的工作区域，即试剂贮存和准备区、标本制备区、扩增反
核酸分子杂交技术
一、 A型题：
1． 要探知细胞内某一蛋白质的表达水平，可以通过
_______实现。 A. Southern blot B. Northern blot C. Western blot D. 原位分子杂交 2． 核酸的变性是_______。
A. 一级结构的断裂 B. 二级结构的破坏 C. 伴有共价键的断裂 D. 是DNA的降解过程。 3． 固相杂交不包括_______。
A. Northern印迹杂交 B. 原位杂交 C. 吸附杂交
D. Southern印迹杂交 4． 染色体原位杂交结果如图所示
羊水细胞间期核与13、18、21、X和Y 染色体的DNA探针杂交。左图显示细胞核与13号染色体（绿）和21号染色体（红）的探针杂交。右图显示细胞核与18号染色体（浅蓝）、X染色体(绿)和Y染色体（红）的探针杂交。请根据该结果得出诊断为_______。
A． 21三体
分子诊断学习题 LucasGu
B． 女性胎儿 C． 染色体微缺失 D． 正常男性胎儿 5． 染色体原位杂交结果如下图
左图：用13号染色体（绿）和
21号染色体（红）的探针与来自羊水的间期细胞杂交，右图：用18号染色体（浅蓝色）、X染色体（绿）和Y染色体(红)的探针与羊水细胞杂交。针对该检测结果判断疾病为_______。
A． 男性21三体 B． 女性21三体 C． DiGeorge综合症 D． 正常胎儿
6． 荧光原位杂交结果如下图
X染色体着丝粒探针（Xcen）和Xp22.3探针都用红
色荧光标记， 根据该结果可诊断为_______。
A. 染色体微缺失 B.
21三体 C. 男性胎儿 D. 正常女性胎儿 7． 荧光素FITC是_______。
A． 异硫氰酸荧光素 B． 四乙基罗达明 C． 德克萨斯红 D． 吲哚二羧菁
二、 B型题
A. 着丝粒探针 B. 染色体涂抹探针 C. 基因座特异探针 D. 端粒重复序列探针
1. 可用于中期及间期细胞，检测染色体的非整倍性 2. 可用于中期及间期细胞，检测微缺失和微重复 3. 可用于中期及间期细胞，检测染色体的非整倍性和端粒微小末端重排
4. 只能用于中期细胞，确定小标识染色体或畸变 5. 重复序列探针
A. 固相杂交 B. 液相杂交 C. Western 印迹 D. FISH
E. Rx-FISH
6. 菌落原位杂交 7. 斑点和狭缝杂交 8. Southern印迹杂交 9.
Northern印迹杂交
10. 复性速率液相杂交 11. 吸附杂交 12. 发光液相杂交 13. 液相夹心杂交 14. 原位杂交
A. DNA的浓度
B. DNA的大小和复杂性 C. 温度 D. 离子强度
15. 影响DNA复性的因素 16. 影响DNA变性的因素 17. 影响核酸分子杂交的因素 三、 X型题
1． 根据性质及来源不同，核酸探针又可被分为
A. 基因组DNA探针 B. DNA探针 C. RNA探针 D. 寡核苷酸探针等
2． 常用的核酸探针非放射性标记物有
A. 地高辛 B. 生物素 C. 酶 D. 荧光素系统
3． 常用的核酸探针荧光素标记物有
A． 异硫氰酸荧光素
分子诊断学习题 LucasGu
B． 四乙基罗达明 C． 德克萨斯红 D． 吲哚二羧菁等 4． 非放射性探针检测方法有
A． 直接法 B． 间接免疫法 C． 直接亲合法 D． 间接亲合法等 5． Southern印迹技术是
A． 检测RNA的核酸杂交技术 B． 是以发明者的名字命名的 C． 属于固相杂交的范畴 D． 可用于遗传病的检测 6． Northern印迹技术是
A． 检测RNA的核酸杂交技术 B． 是以发明者的名字命名的 C． 属于固相杂交的范畴
D． 与Southern印迹杂交的方法类似，只是变性剂
不同
7． 核酸原位杂交是
A． 核酸分子杂交技术与组织细胞化学和免疫组织
化学结合起来的一种杂交方法， B．
基本原理及探针的标记方法与传统核酸分子杂交技术相同
C． 不能确定与探针互补的核酸序列在细胞内的空
间位置
D． 不需要将核酸从细胞中提取出来 8． 荧光原位杂交的标本
A． 中期染色体 B． 间期核
C． 完整细胞或组织切片
D． 最广泛应用的标本是中期染色体 9． 液相分子杂交包括
A． 吸附杂交 B． 发光液相杂交 C． 液相夹心杂交
D． 复性速率液相分子杂交
四、 名词解释
1． 核酸分子杂交 2． 核酸探针 3． Southern 印迹 4． Northern 印迹 5． Western 印迹 6． 染色体原位杂交 7． 重复序列探针 8． 单一序列探针 9． 全染色体涂抹探针 10． 基因座特异探针
11． 变性 12． 复性 13． 增色效应 14． 杂交反应的严格度 15． 退火 16． FISH 17． Rx-FISH 五、 问答题
1. 原位杂交的基本原理
2. 简述原位杂交在临床中的应用。
3. 简述临床诊断常用的FISH探针的类型及用途。 4. 举例说明FISH技术在分子诊断上的应用。 5. M-FISH的原理及其优缺点。 参考答案
一、1、C 2、B 3、C 4、D 5、B 6、A 7、A 二、1.A 2.C 3.C 4. B 5.AD 6.A 7.A 8.A 9.A 10.B 11.B 12.B 13.B 14.A 15.A B C D 16.C D 17. A B C D
三、1．A B C D 2. A B C D 3. A B C D 4. A B C D 5.
B C D 6. A C D 7. A B D 8.A B C D 9.A B C D 四、名词解释
1． 核酸分子杂交：
不同来源的单链核酸分子在合适的温度和离子强度下，通过碱基互补形成双链杂交体的过程称之。
2． 核酸探针：
是指能与待检测的靶核酸序列互补杂交的某种已知序列的核酸片段。它具有高度的特异性，并且一般来讲带有某种适当的标记以便检测。
3． Southern 印迹
将待检测的DNA样品固定在固相载体上（硝酸纤维素膜或尼龙膜），与标记的核酸探针进行杂交，在与探针有同源序列的位置上显示出杂交信号。通过Southern杂交可以判断被检测的DNA样品中是否有与探针同源的片段以及该片段的长度。
4． Northern 印迹
指 RNA 经电泳分离后转移至膜性支持物上进行杂交反应的技术，目前主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA 的表达水平以及比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。
5． Western 印迹
Western印迹又称免疫印迹(immunoblotting)，是一种通过标记的抗体检测经SDS-PAGE分离的特定蛋白质的技术。
6． 染色体原位杂交
荧光原位杂交可以检测非分裂期即间期细胞核的染色体的数量及结构异常这种方法称为染色体原位杂交（chromosome in situ hybridization），是FISH优于传统细胞遗传学技术的重要特点。
7． 重复序列探针
是指与某一条特定的染色体结构结合、特异识别重复DNA
分子诊断学习题 LucasGu
序列的探针如着丝粒探针、端粒探针等。
8． 单一序列探针
指能与位于某条染色体特定的区域或基因的单拷贝DNA序列杂交的探针。
9． 全染色体涂抹探针
来源于一条染色体的DNA文库，这种探针可以识别一条特定染色体全长上的单一序列，从而将一条完整的染色体染色而得以显示（painting）。
10． 基因座特异探针
是与染色体上某一特定基因的单拷贝DNA序列杂交的探针。当已经分离到一个基因的一小段，想检测该基因定位于哪条染色体时，应用该探针。
11． 变性
当有酸、碱、热及某些变性剂（如尿素、乙醇、甲酰胺、胍等）等因素存在时，DNA分子双链间的氢键断裂，解离成两条无规则的卷曲状单链DNA，此现象称之。
12． 复性
去除变性因素后，单链DNA可通过碱基互补重新结合成稳定的双链螺旋结构，此过程称为复性（renaturation）。
13． 增色效应
DNA 变性后，由于双螺旋解体，碱基堆积不再存在，藏于螺旋内部的碱基暴露出来，从而使变性后的DNA 对260nm 紫外光的吸光率比变性前明显增加，这种现象称之。
14． 杂交反应的严格度
在杂交反应中容许错配的程度称之。 15． 退火
当热变性DNA缓慢冷却时，可以复性，这种复性称之。 16． FISH
是一种利用非放射性的荧光信号对原位杂交样本进行检测的技术。它通过荧光标记的探针与待测标本的核酸进行原位杂交，在荧光显微镜下对荧光信号进行辨别和计数，从而对染色体或基因异常的细胞、组织标本畸形检测和诊断。
17． Rx-FISH
Rx-FISH技术是采用多种荧光素混合物标记与人类DNA有高度同源性的猿或其它灵长类动物的DNA作为探针，杂交后使人类的24条染色体呈现特异的带型，根据彩色的荧光条带进行核型分析。
五、问答题
1． 原位杂交的基本原理
样本经适当处理后，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与组织、细胞中待检测的核酸进行特异性结合形成杂交体，然后通过组织化学或免疫组织化学方法在被检测的核酸原位形成的杂交信号，在显微镜或电子显微镜下对待测核酸进行细胞内定位的方法。
2． 简述原位杂交在临床中的应用
原位杂交技术可以通过标记的探针与分裂中期染色体DNA杂交来精确定位特定核苷酸序列在染色体上的位置；与细胞RNA杂交可观察组织细胞中特定基因的表达水平；还可用特异性的细
菌或病毒的核酸序列作为探针与组织、细胞杂交，以确定有无病原体的感染等。原位杂交能在成分复杂的组织中对单一细胞进行研究，不受同一组织中其它成分的影响，因此对于那些细胞数量少且散在于其它组织中的细胞内DNA或RNA的研究更为方便。此外，原位杂交不需要从组织中提取核酸，有利于检测组织中含量极低的靶序列，并可完整地保持组织和细胞的形态，更能准确地反应出组织细胞的相互关系及功能状态。举例：原位杂交检测上皮细胞中人乳头状瘤病毒（HPV）DNA
3． 简述临床诊断常用的FISH探针的类型及用途。 根据核酸探针的序列特点，可将FISH探针分为三大类：重复序列探针、单一序列探针和全染色体涂抹探针。重复序列探针（repetitive sequences probes）是指与某条特定的染色体结构结合、特异识别重复DNA序列的探针如着丝粒探针、端粒探针等。一般来说，不同的染色体，着丝粒重复序列中的核苷酸序列也不同，但端粒重复序列不具有染色体特异性。单一序列探针(Unique sequence probes)与某条染色体上特定的区域或基因的单拷贝DNA序列杂交。包括带特异性探针（band special probes）和基因座特异性探针（Locus Specific probes）等。全染色体涂抹探针（whole chromosome painting probes, WCP）是识别一条特定染色体全长上的单一序列探针的混合物。
种类/主要应用
着丝粒探针：可用于中期及间期细胞，检测染色体的非整倍性；
染色体涂抹探针：只能用于中期细胞，确定小标识染色体或畸变；
基因座特异探针：可用于中期及间期细胞，检测微缺失和微重复；
端粒重复序列探针：可用于中期及间期细胞，检测染色体的非整倍性和端粒微小末端重排
4． 举例说明FISH技术在分子诊断上的应用
21三体，微缺失，肿瘤，病原微生物等的检测与诊断。 5． M-FISH的原理及其优缺点
混合数种荧光原色，形成不同颜色荧光探针，在一次杂交中使每一条染色体都涂上不同的颜色，可同时观察全部染色体(见图9－36)。利用这种技术可以很容易看到多条染色体间的复杂易位情况和确定标识染色体的来源。对于不知来源的基因片段及复杂的基因重组，特别是肿瘤染色体很有帮助。缺点是分辨率不够，细微的缺失可能无法判断；另外接近中心体着丝粒附近的染色质，因不易结合，也不容易判断；同时M-FISH对同一条染色体中的易位或倒位也无法判断，并且它也不能精确地显示染色体断裂的区带。
核酸测序技术
一、A型题
1． 有关DNA链末端终止法的不正确说法是 （ ）
A 需要ddNMP B 需要ddNTP
C dNTP：ddNTP的比例要合适
分子诊断学习题 LucasGu
D 需要放射性同位素 E需要dNTP
2．有关DNA序列自动化测定的不正确叙述是 （ ） A用荧光代替了同位素标记 B激光扫描分析代替人工读序 C基本原理与手工测序相同 D不再需要引物
E需要与手工序列分析相同的模板
3. 有关化学法的叙述，不正确的是 （ ） A所用化学试剂有一定危害性 B 所需的DNA模板纯度要求较高
C 测序前对待测DNA末端进行放射性标记 D 便于自动化
E 测序反应分为4组或5组相互独立的化学反应
4.变形聚丙烯酰胺凝胶电泳能分离的单链寡核苷酸片段，一般为（ ）
A 100～200个核苷酸 B 200～300个核苷酸 C 300～500个核苷酸 D 500～700个核苷酸 E 任意长度均可
5.要能够获得良好的电泳带谱模式，使得DNA 条带分离效果较佳，反应试管中ddNTP和dNTP的比例通常为：（ ） A 1：5 B 1：10 C 1：15 D 1：20 E 1：25
6. DNA自动化测序系统中，最常用的标记物是（ ） A 荧光染料 B α-32P C γ-32P D 生物素 E 35S
二、X型题
1．化学法测序反应体系的组成中包括有（ ） A待测DNA
B待测DNA样品的末端标记 C绝对单一碱基特异性的化学裂解 D电泳测序图谱的识读 E 引物
2．链末端终止法测序反应体系的组成中包括有（ ） A待测模板链 B引物 C DNA聚合酶
D放射性核素标记的dNTP E测序产物的凝胶电泳及识读
3．DNA序列测定的应用有（ ） A 分析基因组核苷酸排列序列 B 分析基因序列 C 基因定点诱变的基础
D 基因工程载体构建中DNA序列定位和排序的基础 E 临床疾病的分子诊断
4．Sanger双脱氧链终止法采用DNA引物引导新生DNA的合成，采用的模板是（ ） A 单链DNA B 双链DNA C 单链RNA D 双链RNA E 蛋白质
三、名词解释
1． 毛细管凝胶电泳（Capillary gel electrophoresis, CGE） 2．DNA杂交测序法(Sequencing by hybridization, SBH) 3．引物步入法（primer walking ） 4．焦磷酸测序技术（pyrosequencing） 四、问答题
1．简述链末端终止法测定 DNA 序列的原理 2. 简述化学法测定 DNA序列的基本原理
第十章 核酸测序技术试题答案
一、A型题
1．有关DNA链末端终止法的不正确说法是 ( A ) A 需要ddNMP B 需要ddNTP
C dNTP：ddNTP的比例要合适 D 需要放射性同位素 E需要dNTP
2．有关DNA序列自动化测定的不正确叙述是 （D ） A用荧光代替了同位素标记 B激光扫描分析代替人工读序 C基本原理与手工测序相同 D不需要引物
E需要与手工序列分析相同的模板
3. 有关化学法的叙述，不正确的是 （ D ） A所用化学试剂有一定危害性 B 所需的DNA模板纯度要求较高
C 测序前对待测DNA末端进行放射性标记 D 便于自动化
E 测序反应分为4组或5组相互独立的化学反应
4.变形聚丙烯酰胺凝胶电泳能分离的单链寡核苷酸片段，一般为（ C ）