第一章 微生物学实验常识 第一节 微生物实验操作常识
环境工程微生物学实验课的目的是：训练学生掌握微生物学最基本的操作技能；了解微生物学的基本知识；加深理解课堂讲授的某些微生物学理论。同时，通过实验，培养学生观察、思考、分析问题和解决问题的能力以及实事求是、严肃认真的科学态度以及勤俭节约、爱护公物的良好作风。
一、实验过程中注意事项
1．每次实验前必须对实验内容进行充分预习，以了解实验的目的、原理和方法，做到心中有数，思路清楚。
2．认真及时做好实验记录，对于当时不能得到结果而需要连续观察的实验，则需记下每次观察的现象和结果，以便分析。
3．实验室内应保持整洁，勿高声谈话和随便走动，保持室内安静。
4．实验时细心仔细，全部操作应严格按操作规程进行，万一遇有盛菌液试管或瓶不慎打破、皮肤破伤或菌液吸入口中等意外情况发生时，应立即报告指导教师，及时处理，切勿隐瞒。
5．实验过程中，切勿使酒精、乙醚、丙酮等易燃药品接近火焰。如遇火险，先关掉火源，再用湿布或砂土掩盖灭火，必要时用灭火器。
6．使用显微镜或其他贵重仪器时，要求细心操作，特别爱护。对消耗材料和药品等要力求节约，用毕后仍放会原处。
7．每次实验完毕后，必须把所用仪器抹净放妥，将实验室收拾整齐，擦净桌面，如有菌液污染桌面或其他地方时，可用3%来苏尔液或5%石炭酸液覆盖其上半小时后擦去，如系芽孢杆菌，应适当延长消毒时间。凡带菌之工具（吸管、玻璃刮棒等）在洗涤前须先消毒（浸泡在3%来苏尔液中）。
8．每次实验须进行培养的材料，应标明自己的组别及处理方法，放于教师指定的地点进行培养。实验室中的菌种和物品等，未经教师许可，不得携出室外。
9．每次实验的结果，应以实事求是的科学态度填入报告内容中，力求简明准确，及时汇交教师批阅。
10．离实验室前应将手洗净，注意关闭门窗，灯、火、煤气等。
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二、接种室
在微生物工作中，菌种的接种移植是一项主要操作，这项操作的特点就是要保证菌种纯，防止杂菌的污染。在一般环境的空气中，由于许多尘埃和杂菌，对接种工作干扰很大，很易污染。因此，接种工作要在空气经过灭菌的环境里进行，小规模的可利用接种箱，大规模的则在接种室里操作，也可在超净工作台中操作。
（一）接种室内设备和用具
接种室内的工作台，不论是什么台面，都要求表面光滑和水平。光滑是便于用消毒药剂擦洗；水平是在倒琼脂平板时可以保证培养皿内平板的厚度一致。
在接种室（或超净工作台）安装一个紫光灯。接种室内的紫光灯，可吊在经常工作的座位的正上方。
缓冲室内应有专用的工作服、鞋、口罩、盛有来苏儿水的瓷瓶和毛巾、手持喷雾器和5％石炭酸溶液等。
接种室内有酒精灯、常用接种工具、不锈钢制的刀、剪、镊子、70％的酒精棉球、工业酒精、载玻片、记录本、标签纸、废物筐等。
（二）接种室的灭菌消毒
1．熏蒸灭菌：接种室使用时间较长，污染比较严重，应进行熏蒸灭菌。可用甲醛、乳酸或硫磺熏蒸。熏蒸前应将接种室清扫干净，打开通气窗通风干燥。这是接种室彻底灭菌的措施。
2．石炭酸喷雾：在每次接种前，用5％石炭酸喷雾，可促使空气中微粒及杂菌沉降，防止桌面、地面上微尘飞场，并有杀菌作用。
3．紫外线照射：有条件时在每次接种前，应开启紫外线灯，照射半小时以上（一般不必超过一小时），有较好的杀菌效果。
（三）接种室工作程序
1．每次使用前半小时，接种室和缓冲室内用5％石炭酸喷雾。有紫外线灯时可照射半小时。
2．用肥皂洗手。把所需器材搬入缓冲室。换上经常灭菌的工作服、工作帽和工作鞋（旧的衣帽鞋洗干净后灭菌即可），戴好口罩，然后用2％煤酚皂液将手浸洗2min。
3．将各种需用物品般进接种室，按一定位置放好。检查是否齐备。用5％石炭酸重点在工作台面上方和附近地面上喷雾，然后退回隔离室，稍停几分钟，再进接种室工作。
4．接种操作前用70%酒精棉球擦手，进行无菌操作时，要严格认真，动作要轻
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缓，尽量减少空气波动，如二人操作，要相互配合好。工作时用完的火柴、废纸等，不要仍在地上，应丢道废物桶内。
5．工作结束后，立即将台面收拾干净，将不应在接种室存放的物品和废弃物全部拿出接种室，然后用5%石炭酸全面喷射，开紫外线灯照射半小时。
6．工作中应主要安全。如遇棉塞着火，用手紧握即可熄火，如来不及时，应用湿布扑灭，切勿用嘴吹，以免扩大燃烧；如遇有菌培养物洒落或打碎有菌容器时，应用抹布沾5％石炭酸收拾到废物桶内并擦拭台面或地面，用酒精棉球擦手后再继续操作。
（四）接种室空气污染情况的检验
接种室应定期进行空气污染情况的检验，其目的是了解接种室灭菌效果，另外是了解在操作过程中操作行动对空气的污染影响，以便有的放矢地及时改进灭菌措施和操作方法。
1．检验方法
（1）平板检验法：用培养微生物主要类群的常规培养基，如肉汤琼脂、淀粉琼脂、土豆琼脂，分别倒成平板，每种两个，都放入接种室内。检验时，按无菌操作各将其中一个平板的盖子打开，经过预定时间后再行盖好，另外一个不开盖子的作为对照，一起放入30℃环境培养，48h后检验有无菌落生长。
（2）斜面培养法
将常用的琼脂斜面（与上相同）各取2管，放入接种室。按无菌操作各将其中的一管打开棉塞，将棉塞放入灭菌的培养皿内。经过预定时间后，再将棉塞通过火焰塞好试管。连同对照一起培养，48h后检验有无杂菌生长。
2．检验方法
（1）空气灭菌后的检验：接种室用甲醛或其它药剂熏蒸后，在开始使用前半小时或一小时打开培养皿盖子，至使用接种室时盖好。其目的是为了检验接种室内空气灭菌的效果。
（2）操作过程中空气污染情况的检验：为了检验在使用接种室的过程中，由于人员的进出、器材的搬放、接种操作的动作等原因造成的空气污染的情况，可在淮备工作结束后接种操作开始时打开盖子，经5分钟、30分钟或直到工作结束时再盖好，以检验在不同的使用时间内空气污染的程度。
（3）紫外线灭菌效果的检验：接种室用紫外线灯照射后，可在不同高度和不同位置用琼脂平板检验空气中的杂菌，以判断紫外线的灭菌效果。必要时应调整照射时间或紫外线灯的高度。
3．检验结果分析：检验用的平板或斜面，在30℃培养48h后，检验是否长有菌落、菌落数量、并由菌落形态判断杂菌的种类。一般要求平板开盖5分钟者应不超过3个菌落；
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斜面开塞30分钟者应不长菌落为合格。从空气中杂菌的种类可以考虑采取有效措施，增进灭菌效果。如霉菌较多，可先用5％石炭酸灭菌后，再用甲醛熏蒸；如细菌较多时，可采用乳酸与甲醛交替熏蒸的办法。
第二节 实验室常用显微镜
自从17世纪荷兰人列文虎克发明了显微镜后，人类才第一次看见了细菌。本世纪30年代，电子显微镜的问世，人类才真正地揭示了微观世界的奥妙，不但看到了细胞的亚显微结构，而且也弄清了超微生物－病毒的真正面目。40年代层析技术的分离和电泳技术的出现和兴起，大大地推动了分子生物学的研究，诸如核酸、酶、蛋白质分子的分离、分析和分子的结构的测定。近几十年来，红外光谱、紫外光谱和质谱、核磁共振波谱等技术的应用和发展，弄清了许多有机分子的结构。随着激光、超导等技术的不断涌现，将把微生物学实验技术推向一个崭新的水平。
一、显微镜
人眼观察物体的能力是有限的。一般情况下，在25cm的明视距离内，人眼只能分辨相距0.1～0.2mm的两个物体。也就是说，当两个物体相距不到0.1mm时，人眼也就把它们看成是一个物体了。这个极限称为人眼的分辨力。由此可知，人眼对小到一定距离的物体，如普通的细菌，就只能是“视而不见”。自从显微镜发明后，变产生了微生物学，它大大地推动了生物科学的发展，使人类从宏观世界走向微观世界。
（一）光学显微镜 1、普通光学显微镜
普通光学显微镜由机械部分和光学系统两大部分所组成。机构部分包括：镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台等；光学部分包括：目镜、物镜、聚光器、反光镜和光源等。
普通光学显微镜的特点：结构简单、操作方便、成像清晰、价格低廉、种类繁多、用途十分广泛。
2、暗视野显微镜
若将普通光学显微镜的聚光器换成暗视野聚光器，就可变为一架暗视野显微镜。从暗视野显微镜目镜中观察，视野全是黑暗的，只有被检物体（细菌）才是明亮的。由于所见到的菌体仅仅是个轮廓，而看不清其内部结构，故只能在观察菌体时使用。
3、荧光显微镜
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荧光显微镜与暗视野显微镜的结构是相同的，只是把普通光源换成一个激发荧光的紫外光源，紫外光光源通常采用高压汞灯。荧光显微镜主要用于科研、教学、医药和微生物等研究工作中。
4、相差显微镜
如果要观察透明的活体微生物，由于光线透过它时光的波长和振幅不发生变化，所以整个视野的亮度是均匀的，因而一般的显微镜不能分辨出微生物细胞的细微结构。若采用相差显微镜即可弥补上述不足。
相差显微镜的结构除了与普通显微镜一样外，所不同的是在聚光器下方插入了一个环状光栏，另有几个安装相板的相差物镜及合轴调整望远镜三个特殊部分。国内常用的有：XSX-1型与XSX-2型相差显微镜（南京江南光学仪器厂产品）。相差显微镜主要用于科研、教学、医疗等部门作细菌学、病理学的研究观察。
5、偏光显微镜
在生物体中，某些组织成分由于光学性质不同，可不经染色，利用偏光来加以区别。偏光显微镜就是利用它的特殊装置－偏光器、检偏器和补偿器等，使在镜检时产生偏光以鉴别细微结构，同时还可以辨别组织中的化学成分，因此可用于组织化学的研究中。
6、紫外光显微镜
该镜是以紫外光为光源。由于被检物体内各种组分对紫外光吸收能力不同，因此，在以紫外光显微镜镜检时，可使未染色的标本容易辨别。同时，又因紫外光的波长比可见光要短一半，从而使它的分辨力增加了两倍，所以能看到用染色方法所看不到的结构。该镜对核酸的研究尤为重要。
（二）电子显微镜
电子显微镜的一切性能都是光学显微镜不能比拟的。光学显微镜的放大倍数只有两千倍，而电子显微镜的放电倍数则为一百多万倍。目前，电子显微镜技术（electron microscopy)已成为研究机体微细结构的重要手段。
常用的有透射电镜（transmission electron microscope，TEM）和扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）。与光镜相比电镜用电子束代替了可见光，用电磁透镜代替了光学透镜并使用荧光屏将肉眼不可见电子束成像。
电子显微镜不但放大能力强，而且分辨率高，光学显微镜的分辨率为0.2μm，而电子显微镜的分辨率已达到0.3nm。一般原子的间距大约为0.1nm，因此电子显微镜可以观察到原子世界。这个分辨率比光学显微镜提高了3000多倍。
电子显微镜主要由电子发射源（又称电子枪）、会聚透镜、接物透镜、投射透镜、记录系统、高压电源与低压电源、真空系统等七大部分组成。
1、扫描电镜
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