7．清洗： 使用完毕后，将计数器在水龙头上用水柱冲洗，且勿用硬物洗刷，洗完后自行凉干或吹干。镜检，观察每小格内是否有残留菌体或其它沉淀物。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。
五、实验结果
计算样品中酵母菌的浓度，并将实验结果填于下表：
计数次数 1 2 3 1 各中格中的酵母菌数 2 3 4 5 1ml菌液中总菌数 三次计数平均数 六、思考题
1）为什么用两种不同规格的计数板测同一样品时，其结果一样？
2）根据你的实验体会，说明用血球计数板计数的误差主要来自哪些方面？应如何尽量减少误差，力求准确？
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实验 4 微生物染色
一、实验目的
1．学习微生物涂片染色的操作技术
2．掌握微生物的普通染色法（简单染色法）和革兰氏染色法
二、实验器材
1．菌种（由实验室提供）
2．显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、香柏油、二甲苯、废液缸、洗瓶、擦镜纸、吸水纸等。
3．染料： 美蓝染液、草酸铵结晶紫染液、革氏碘液、95％乙醇、蕃红染液、
三、染色原理
微生物（尤其是细菌）的机体是无色透明的，在显微镜下，由于光源是自然光，使微生物体与背景反差小，不易看清微生物的形态和细微结构，若增加其反差，微生物的形态就可看得清楚。通常用染料将菌体染上颜色以增加反差，便于观察。
微生物细胞是由蛋白质、核酸等两性电解质及其它化合物组成。所以微生物细胞表现出两性电解质的性质。两性电解质兼有碱性基和酸性基，在酸性溶液中离解出碱性基呈碱性带正电。在碱性溶液中离解出酸性基呈酸性带负电。经测定，细菌等电点在pH＝2～5之间，故细菌在中性(pH=7)、碱性（pH>7）或偏酸性（pH=6～7）的溶液中，细菌的等电点均低于上述溶液的pH值，所以细菌带负电荷，容易与带正电荷的碱性染料结合，故用碱性染料染色的为多。碱性染料有美蓝、甲基紫、结晶紫、龙胆紫、碱性品红、中性红、孔雀绿和蕃红等。
微生物体内各结构与染料结合力不同，故可用各种染料分别染微生物的各结构以便观察。染色方法分简单染色法和复染色方法。
（一）简单染色
简单染色法又叫普通染色法，只用一种染料使细菌染上颜色，如果仅为了在显微镜下看清细菌的形态，用简单染色即可。
（二）复染色法
用两种或多种染料染细菌，目的是为了鉴别不同性质的细菌，所以又叫鉴别染色法。主要的复染色法有革兰氏染色法和抗酸性染色法。抗酸性染色法多在医学上采用。此处仅介绍革兰氏染色法。革兰氏染色法是细菌学中很重要的一种鉴别染色法。它可将细菌区别为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两大类。它的染色步骤如下：先用草酸铵
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结晶紫染色，经碘－碘化钾（媒染剂）处理后用乙醇脱色，最后用蕃红液复染。如果细菌能保持草酸铵结晶紫与碘的复合物而不被乙醇脱色，用蕃红液复染后仍呈紫色者叫革兰氏阳性菌。被乙醇脱色用蕃红复染后呈红色者为革兰氏阴性菌。
四、实验步骤
（一）细菌的简单染色步骤
1．涂片
取干净的载玻片于实验台上，在正面边角作个记号并滴一滴无菌蒸馏水于载玻片的中央，将接种环在火焰上烧红，待冷却后从斜面挑取少量菌种与玻片上的水滴混匀后，在载玻片上涂布成一均匀的薄层，涂布面不宜过大。（注：活性污泥染色是用滴管取一滴活性污泥于载玻片上铺成一薄层即可。） 2．干燥
最好在空气中自然晾干，为了加速干燥，可在微小火焰上方烘干。但不宜在高温
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图7-1无菌操作及涂片的过程 下长时间烤干，否则急速失水会使菌体变形。 3．固定
将已干燥的涂片正面向上，在微小的火焰上通过2-3次，由于加热使蛋白质凝固而固着在载玻片上。 4．染色
在载玻片上滴加染色液（草酸铵结晶紫或美蓝任选一种)，使染液铺盖涂有细菌的部位作用约1min。 5．水洗
染色时间到后，倾去染液，斜置载玻片，以自来水冲洗，直至冲下之水无色时为止。注意冲洗水流不宜过急、过大，水由玻片上端流下，避免直接冲在涂片处。
6．吸干
冲洗后，将载玻片倾斜，用吸水纸吸去涂片边缘的水珠(注意勿将细菌擦掉)。将标本晾干或用吹风机吹干。 7．镜检
待标本片完全干燥后，用显微镜观察，并用铅笔绘出细菌形态图。 (二)细菌的革兰氏染色步骤
1．制片：取实验室提供的菌种G+和G-两种各一环按简单染色法作涂片（见图7-1所示），干燥并固定，为了便于比较可在同一块载玻片上制成两个涂面。
2．染色： 用草酸铵结晶紫染色液染色1min，用清水冲洗。 3．媒染： 用革氏碘液媒染1min，水洗。
4．脱色： 斜置载玻片于一烧杯之上，滴加95％乙醇脱色，至流出的乙醇不现紫色即可，随即水洗。（注：为了节约乙醇，可将乙醇滴在涂片上静置30s～45s，水洗。） 5．复染： 用蕃红染液复染1min，水洗、凉干。染色结果见图7-2所示。
6．镜检： 将凉干后的标本片置显微镜下，用低倍镜观察，发现目的物后用油镜
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观察，注意细菌细胞的颜色。绘出细菌的形态图并说明革兰氏染色的结果。
染色关键：必须严格掌握乙醇脱色程度，如果脱色过度，阳性菌被误染为阴性菌；若脱色不够时，阴性菌被误染为阳性菌。
五、实验结果
你用简单染色和革兰氏染色后看到的细菌是什么颜色？什么形状？画出所观察到细菌的草图并注明放大倍数。
六、思考题
1．制片为什么要完全干燥后才能用油镜观察? 2．微生物经固定后是死的还是活的？ 3．微生物的染色原理是什么？
图 7-3 接种针（环）灭菌 附：涂片无菌操作要点
1．无菌操作的试管或三角瓶在开塞后及回塞之前，其口部应通过火焰2—3次，以烧去可能附着于管口或瓶口的微生物。开塞后的管口及瓶口应尽量靠近火焰，尽量平放，切忌口部向上及长时间暴露于空气中，以防污染。
2．接种环(针)于每次使用前后均应在火焰上彻底灼烧灭菌(图7-3)。挑菌前，必须待接种环(针)冷却后才使用。
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