四、操作步骤
(一)玻璃器皿的洗涤和包装 1．洗涤
玻璃器皿在使用前必须洗涤干净。培养皿、试管、锥形瓶等可用洗衣粉加去污粉洗刷并用自来水冲净。移液管先用洗液浸泡，再用水冲洗干净。洗刷干净的玻璃器皿自然晾干或放人烘箱中烘干、备用。
2．包装
（1）将移液管放在4-5 cm宽的长纸条的一端，移液管与纸条约成30°夹角，折叠包装纸包住移液管的尖端(如图8-1)，用左手将移液管压紧，在桌面上向前搓转，纸条螺旋式地包在移液管外面，余下纸头折叠打结。按实验需要，可单支包装或多支包装，待灭菌。
（2）用棉塞将试管管口和锥形瓶瓶口部塞住
棉塞可过滤空气，防止杂菌侵入并可减缓培养基水分的蒸发，故在微生物工作中一直普遍使用。
棉塞的制作（见图8-2和图8-3）：按试管口或锥形瓶口大小估计用棉量，将棉花铺成中心厚，周围逐渐变薄的圆形或方形，对折后卷成卷，一手握粗端，将细端塞入试管或锥形瓶的口内，棉塞不宜过松或过紧，用手提棉塞，以管、瓶不掉下为准。棉塞四周应紧贴管壁和瓶壁，不能有皱折，以防空气微生物沿棉塞皱折侵入。棉塞插入2/3，1/3留在管口(或瓶口)外，便于拔塞。试管、锥形瓶塞好棉塞后，用牛皮纸包并用
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图8-2 棉塞 （a）正确 （b）、（c）不正确 细绳或橡皮筋捆扎好放在铁丝或铜丝篓内待灭菌。
（3）培养皿由一底一盖组成一套，用牛皮纸或报纸将10套培养皿(皿底朝里，皿
图8-3 棉塞制作过程 盖朝外，5套、5套相对)包好。
（二）培养基的配置过程
1．称量：按照培养基配方，准确称取各成份放于烧杯中。
2．熔化：向上述烧杯中加入所需要的水量，搅匀，然后加热使其熔解，如是配制固体培养基，在琼脂熔化的过程中，需不断搅拌，并控制火力不要使培养基溢出或烧焦。待完全熔化后，补足所失水份。如果配方中含有淀粉，则需先将淀粉用少量冷水调成糊状并在火上加热搅拌然后加足水份及其
图8-4 培养基的分装 他药品，待完全熔化后，补足所失水份。
3．调pH值：初制备好的培养基往往不能符
合所要求的pH值，故需用pH试纸或酸度计矫正．用10%NaOH或10%HCl调pH至所需范围。
4．过滤：用滤纸或多层纱布过滤，一般无特殊要求的情况下，这一步可以省去。 5．分装：根据不同的需要，可将制好的培养基分装入试管内或三角瓶内，管(瓶)口塞上棉塞。分装装置如图8-4。注意不要，使培养基沾染在管（瓶）口上以免浸湿棉塞，引起污染。（注：本实验固体培养基采用灭菌后分装）
（1）液体：分装高度以试管高度的1/4左右为宜。
（2）固体：分装试管，其装量为管高的1/5，灭菌后制成斜面（图8-5）。分装
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三角瓶的容量以不超过三角瓶容积之一半为宜。
（3）半固体：分装试管一般以试管高度的1/3为宜，灭菌后，垂直待凝成半固体深层琼脂。
6．灭菌：培养基分装好了以后，塞上棉塞，外面再包一层牛皮纸，便可进行灭菌。培养基的灭菌时间和温度，需按照各种培养基的规定进行，以保证灭菌效果和不损培养基的必要
图8-5 摆斜面 温室培养24小时，无菌生长者方可使用。
（三）无菌水或稀释水的制备
取500mL锥形瓶盛有200mL自来水或蒸馏水，瓶口用棉塞塞好，并用牛皮纸包扎紧。高压蒸汽灭菌即可。使用时用灭菌的吸管吸取。
（四）、配制培养基的配方
根据实验需要选择下列配方，其它培养基的配方参看附录。 1．肉汤蛋白胨培养基
牛肉膏 3g；蛋白胨 10g；NaCl 5g；琼脂 20g；蒸馏水1000mL；pH 7.0～7.2； 灭菌：1.05kg/cm2；温度121℃；维持20min。
2．查氏培养基
NaNO3 2g；MgSO4 0.5g；琼脂 20g； K2HPO4 1g；FeSO4 0.01g；蒸馏水 1000mL；KCl 0.5g；蔗糖 30g；pH 自然 灭菌：0.7kg/cm2；时间：20min。
3．淀粉琼脂培养基（高氏一号）
可溶性淀粉 20g；FeSO4 0.5g；KNO3 1g；琼脂 20g；NaCl 0.5g；K2HPO4 0.5g； MgSO4 0.5g；蒸馏水 1000Ml； pH 7.0~7.2 灭菌：1.05kg/cm2；时间：20min。 （五）灭菌
灭菌与消毒二者含意不同，前者是指杀死或消灭一定环境中的所有微生物；后者是指消灭病源菌或有害微生物而言。灭菌与消毒的方法很多，但总的可以分为物理法和化学法两大类。物理的方法包括加热灭菌(湿热灭菌、干热灭菌)，过滤除菌、紫外线灭菌等。化学的方法主要是利用有机或无机的化学药品对实验室用具和其他物体表
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成份。培养基经灭菌后，必须放37℃
面进行灭菌与消毒。下面分述各灭菌消毒方法的基本原理及操作步骤。
1.紫外线灭菌：
紫外线灭菌是用紫外灯管进行的。波长为200～300nm的紫外线都有杀菌能力，其中以260nm的杀菌力最强。紫外线的杀菌作用主要是因为它诱导了胸腺嘧啶二聚体的形成，从而抑制了DNA复制所致。另一方面，空气在紫外线照射下，可产生臭氧(O3)，臭氧也有一定的杀菌作用。紫外线透过物质的能力很差，所以只适用于空气及物体表面的灭菌，它距照射物以不超过1.2米为宜。
操作方法：
接种室常用紫外光灯作空气灭菌，为了加强紫外线灭菌的效果，在开灯以前，可以在接种室内喷洒石炭酸溶液，一方面使空气中附着有微生物的尘埃降落，另一方面也可以杀死一部分细菌。接种室内的桌面，凳等可用2—3％的来苏尔擦洗。然后再开紫外光照射30分钟左右。紫外线对人体也有伤害作用，所以不能直视开着的紫外灯光，也不能在开着灯的情况下工作。
为了检验紫外线灭菌的效果，可以在灭菌后的接种室内，桌上和桌下各放一套已倾入肉汤蛋白胨培养基的培养皿，把皿盖打开15分钟然后盖上，置37℃培养，如果每个平皿的菌落不超过4个，则可认为灭菌的效果良好，若菌落很多，则需延长照射时间或同时加强其它的措施。
2.加热灭菌
加热灭菌包括湿热和干热两种，湿热灭菌又可分成高压蒸汽灭菌、间歇灭菌、煮沸消毒等，干热灭菌又可分成直接灼烧、恒温干燥箱灭菌等。但无论哪种加热的方法，其基本原理是一样的，即通过不同的加热方法使细菌体内蛋白质凝固变性，而达到杀灭细菌的目的。蛋白质的凝固变性与蛋白质中含水量的多少有关，含水份较多者，其凝固所需要的温度较低，反之，含水份较少者需较高温度才能使蛋白质凝固，因此杀灭芽孢比杀灭营养体所需要的温度高。
在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，因为在湿热情况下，菌体吸收水份，使蛋白质易于凝固，同时湿热的穿透力强，而且当蒸汽与被灭菌物体接触凝成为水时，又可放出热量，使温度迅速增高，从而增加灭菌效力。
几种加热灭菌的操作方法分述如下。
1）高压蒸汽灭菌 高压蒸汽灭菌是利用高压蒸汽来达到灭菌的目的，其温度在100℃以上，有强大的杀菌能力。灭菌时是用高压蒸汽灭菌锅进行的。微生物实验所需的一切器皿、器具、培养基（不耐高温者除外）等都可用此法灭菌。
高压蒸汽锅是耐一定压力的密闭金属锅，有立式和卧式两种。灭菌锅上附有压力
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表、排气阀、安全阀等。本实验室灭菌锅是电源加热。
其操作方法：
（1）加水： 打开灭菌锅盖，向锅内加入适量的水。或从加水口处加水入锅内。 （2）装锅： 加水后，将待灭菌的物品放入锅内，注意不要放得太挤，以免影响蒸气的流通和灭菌效果。然后关严锅盖，对角式均匀旋紧螺旋，打开排气阀。
（3）点火：打开电源开关，加热。
（4）关闭排气阀：待锅内水沸腾后，则视排气阀排出蒸汽相当猛烈且微带蓝色时，可关闭排气阀。此时蒸汽将锅内冷空气驱净。
（5）升压、升温：关闭排气阀以后，锅内成为密闭系统，蒸汽不断增多，压力计和温度计的指针上升，当压力达到1.05kg/cm2（温度为121℃）即灭菌开始，这时调整火力大小使压力维持在1.05kg/cm215～30min。除含糖培养基用0.56kg/cm2压力外，一般都用1.05kg/cm2压力。
（6）中断热源：达到灭菌时间要求后停止加热，任其自然降压，当指针回到“0”时，打开排气阀（请注意，排气阀不能过早打开，否则培养基因压力突降，温度没下降而使培养基翻腾冲到棉塞处，既损失培养基有玷污了棉塞）。
（7）出锅：排气完毕，即可扭松螺旋柄使锅盖松动。此时应该将锅盖提高1～2cm，并不推开，使用锅内的余热使棉塞、包头纸等烘干。15～20min后。再推开锅盖，取出器物，排掉锅内剩余水。
（8）待培养基冷却后置于37℃恒温箱内培养24h，若无菌生长则放入冰箱或阴凉处保存备用。若是斜面培养基，从锅内取出后立即摆成斜面，待凝后也放于37℃培养，若无菌，保存备用。
高压蒸汽灭菌是应用最广的一种灭菌方法，一般培养基、玻璃器皿以及传染性标本等都可应用此法灭菌。但应用此法灭菌是否彻底的一个重要关键是在压力上升之前，必须先用蒸汽将锅内的冷空气完全驱尽，否则，虽然压力表已指向1.05kg/cm2，但锅内的温度却还只有100℃，结果往往会造成灭菌不彻底。
2）间歇灭菌 有些培养基如明胶培养基、牛乳培养基等因不耐高温，故需用间歇灭菌法。间歇灭菌的温度和时间是100℃，30分钟。这样的温度和时间足以杀死一切细菌的营养体，但是不能杀死芽孢，因此采用此法灭菌是将待灭菌物经第一次灭菌后（100℃、30分钟)，取出置温箱培养，使其中芽孢萌发为营养体，第二日再经100℃，30分钟灭菌，以杀灭发育的营养体。但恐其中仍有芽孢残留，因此第三天再经培养灭菌，以达彻底灭菌。此法可用阿诺氏(Arnold)流动蒸汽灭菌器或普通蒸笼均可，不需加压，所以可普遍使用。但因手续麻烦，时间长，故一般能用高压蒸汽灭菌的均不采用间歇灭菌法。
3）火焰灭菌
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