目 录
1.4.1.4.1在食品微生物检测中的应用 ................................. 9 1.4.1.4.2在转基因食品检测中的应用 ................................ 10 1.4.1.5 基因芯片存在问题与展望 .................................... 10 1.5 本实验研究的主要目的和意义 ....................................... 11
第二章 应用实时荧光PCR筛选玉米转基因品系 ........................................................ 12
2.1 实验材料 ......................................................... 12 2.2 实验仪器与试剂 ................................................... 12
2.2.1 实验仪器 .................................................... 12 2.2.2 实验试剂与耗材 .............................................. 13 2.3 两种试剂盒的提取方法以及效率比较 ................................. 13
2.3.1 提取方法 .................................................... 13 2.3.1.1 离心柱法（TIANGEN） ....................................... 13 2.3.1.2 离心柱法（TAKARA） ........................................ 14 2.3.2玉米样品DNA浓度的测定 ...................................... 14 2.4 实时荧光PCR反应 ................................................. 14 2.5结果与讨论 ........................................................ 16
2.5.1不同加工程度玉米DNA浓度测定结果 ............................ 16 2.5.2 应用实时荧光PCR筛选玉米转基因品系 .......................... 18 2.5.2.1玉米颗粒6743的扩增效果分析 ............................... 18 2.5.2.2粉碎玉米粒7167的扩增效果分析 ............................. 19 2.5.2.3玉米粉6979扩增效果分析 ................................... 21 2.5.2.4玉米酒槽粕4504扩增效果分析 ............................... 22 2.6 本章小结 ......................................................... 24
第三章 应用基因芯片筛选玉米转基因品系 ............... 25
3.1 基因芯片方法 .................................................... 25 3.2 利用基因芯片筛选玉米中转基因品系的结果 .......................... 25
3.2.1玉米颗粒6743的芯片结果 ..................................... 26 3.2.2粉碎玉米粒7167的芯片结果 ................................... 26 3.2.3 玉米粉6979的芯片结果 ....................................... 27 3.2.4 玉米酒槽粕4504的芯片结果 ................................... 28
3.3 基因芯片法和实时荧光PCR反应检测结果对比 ......................... 29
IV
目 录
3.4 本章小结 ......................................................... 30
第四章 薯格、干酵母转基因成分的检测以及品系鉴定 ....... 31
4.1进口薯格中转基因成分的检测 ........................................ 31
4.1.1实验方法 .................................................... 31 4.1.2结果与讨论 .................................................. 31 4.1.2.1 薯格中转基因成分的初筛 .................................... 31 4.1.2.2薯格中转基因品系检测结果 .................................. 32 4.2干酵母中转基因成分的测定以及品系鉴定 .............................. 33
4.2.1实验方法 .................................................... 34 4.2.2结果与讨论 .................................................. 34 4.2.2.1 干酵母中转基因成分的初筛 .................................. 34 4.2.2.2干酵母中转基因品系筛选结果 ................................ 35
参考文献 .............................................. 36 致 谢 ............................................... 39
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第一章 绪论
第一章 绪 论
1.1研究背景 1.1.1转基因发展概况
转基因产品对我们来说已然不陌生，便是使用分子生物学技术把人们所需要的某些
物种的基因转接到一些物种中去，向着人们所需要的性状发展。近年来转基因技术发展快速，在农作物生产利用方面相当广泛，主要用于防治虫害和提高农作物产量等方面，转基因大豆、棉花、玉米、大米等农作物无论是品质还是产量都得到了较大的改善。一方面，转基因作物的迅速发展也引起人们对转基因作物所带来的食品安全的关注，关于转基因食品是否安全地话题从未终止；另一方面，尽管转基因食品的安全性并没有得到确定性的验证，但是由于转基因食品的巨大利益和前景，全球大多数国家都根据不同的需要进口转基因作物[1]。就标识问题而言，雀巢公司作为世界最大的食品生产公司之一，在1999年到2009年期间，被检出很多食品具有转基因成分，包括婴儿纯米粉、甘脆朱古力、百福豆乳、凤仙雪条、百福豆腐花巢等，对此，中华人民共和国农业部农业回复: ―国家对农业转基因生物实行标识制度‖[2]，也就是说要进入中国国境的转基因食品，必须具有转基因标识; 没有标识或者是标识不符合规定的，禁止进口或销售。
上个世纪80年代，科学家以烟草为材料，成功地研制出了世界上第一个转基因作物，自此以后，转基因技术得到了迅速的发展。如今人们接触到产品很多都含有转基因成分，比如说大豆、水稻、马铃薯和棉花、西红柿等。目前我国转基因作物的进口量十分巨大，尤其是转基因大豆和玉米的进口。 1.1.2玉米、马铃薯转基因品系鉴定现状 1.1.2.1转基因玉米品系鉴定现状
目前，依据我国农业部的最新公告：SN/T1196-2003《玉米种转基因成分定性PCR检测方法》中规定了对玉米Btl l、T14/T25、DAS．59122、CBH351、MIR604、3272、GA21、 MON88017、Evebtl76、MON89034、MON810、NK603、TCl507、MON87460、
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第一章 绪论
MON863品系中转基因成分的定性检测[3]。伴着转基因的进一步发展，科学家将越来越多的重组DNA导入到农作物中，刘岩等[4]将脱氢酶基因gutD从大肠杆菌分离出来，并将其导入玉米中。Li等[5]从盐芥中获取了TsVP基因，并将其导入玉米基因组中。然而这些导入的片段很多都无法检测。因为转基因片段插入的随机和不可控性, 这就要求检验检疫人员尽最大努力的检测到所有外源基因, 让人们有选择和知情的权利。除了上述我国行业标准中有明确规定的转基因玉米品系, 欧盟标准中还有我国未批准的转基因玉米Btl0、Bt176、98140、LY038等品系，对于这些品系，我国并没有明确的公告及方法，检测的准确性也不高。
1.1.2.2转基因马铃薯品系鉴定现状
马铃薯(Solunum tuberosum)，高淀粉茄科作物，京杭收到害虫的侵袭，出于获得优良的植物品系，人们通过应用转基因技术获得高抗虫、高含量、高蛋白质的马铃薯品种
[6]
。当前，商业化种植的转基因马铃薯分为两类，包括抗病毒和抗马铃薯甲虫两种[7]。
重组马铃薯多选用tbcS座为启动子，NOS为终止子，NPTII作为荧光筛选基因。
1.2 转基因植物提取方法概述
随着植物转基因技术的广泛开展，全世界的学者们建立了多种植物DNA提取方法[8]。总结这些方法，我们发现这些DNA的提取方法原则上基本相同，主要机理都是通过破碎细胞，获得DNA，去除蛋白质、多糖等杂质，最后分离提纯DNA等一系列步骤。在DNA提取过程中，蛋白质、多糖及次生代谢产物，这些植物中固有的成分影响DNA的提取纯度；而且细胞内多酚的存在可能会降解植物DNA，降低限制性内切酶、DNA聚合酶及DNA连接酶等的生物活性，对后续的检测必然造成影响[9.10]。十二烷基磺酸钠(SDS)法和十六烷基三乙基澳化胺(CTAB)法、DNA提取试剂盒法、磁珠吸附法是现前经常使用的提取DNA的方法[11] 。 1.2.1十六烷基三乙基澳化馁(CTAB)法
CTAB，在高盐的情况下与DNA结合形成结合物，该复合物可溶解、存在稳定;低盐溶液中，该复合物形成沉淀。接着加入有机溶剂将蛋白质和核酸进行分离，加入RNA酶去除RNA，用异丙醇沉淀DNA ，最后用适宜浓度的乙醇进行漂洗。目前，在根据传统CTAB方法的原理上，人们为了满足不同的实验需要，大多对传统的CTAB法在
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第一章 绪论
不同程度上进行了改良。李艺等[12] 利用CTAB法提取出玉米基因组DNA，通过电泳显示扩增目标条带分明,基本上可以满足SSR--PCR检测的需求。魏琦超等[13]阴利用改良CTAB法成功的提取小麦干种子总DNA，结果证实该法提取的DNA产率好、质量高，完全满足分子生物学下游实验的要求。李金路等[14]以10种植物为基础，在传统CTAB的方法上进行改良，结果表明改良后的方法得到的DNA纯度高，PCR的效果也比较好。
1.2.2十二烷基磺酸钠(SDS)法
十二烷基磺酸钠((SDS)，在高温的条件下,SDS可以高效破裂细胞膜，和多糖、蛋白质结合，过滤后就能除去这些杂质;接着为了除去RNA，加入RNA酶;再加入中性溶液提高盐浓度，使SDS一蛋白质复合物的溶解度变得更低，使沉淀更加完全，去沉淀，留上清；最后使用有机溶剂抽提DNA，无水乙醇沉淀和漂洗DNA。现在，因为应用传统的SDS法，过程繁琐，且DNA效率低，所以现在大多数实验室并不用传统的SDS方法进行提取。吴则东等[15]采用改良后的SDS法提取甜菜干中的DNA，再采用1%琼脂糖进行电泳，其结果为：SDS法提取的DNA纯度高，电泳后的条带比较清晰，能够满足下游分子生物学技术的要求。 1.2.3离心柱吸附提取DNA
DNA提取试剂盒快速，能够在两个小时内进行快速提取，其原理在高盐溶液中，是因为离心吸附柱能够和植物体内的脱氧核糖核酸特异性结合，加入漂洗液进行漂洗、溶解蛋白质、糖类等物质，离心，去除漂洗液；最后在低离子浓度下，用TE洗脱并保存植物组DNA。目前市场上有很多种针对不同植物材料的DNA提取试剂盒，针对这些试剂盒，鲜有相关报道分析、比较不同试剂盒的DNA提取效率、能否能够满足后续分子生物学实验的需求 。 1.2.4磁珠法提取DNA
磁珠法的提取原理和硅胶膜离心柱法有些相似，它是通过在提取过程中加入纳米级磁珠微珠，其表面含有一种能结合核酸的官能团。目前市场上常用的磁珠微珠分为两类，即硅磁、离心磁珠。其原理是在磁场的作用下，植物组细胞破碎，核酸和磁珠结合，分离出了多糖、蛋白质，然后用TE洗脱核酸，最后在磁场作用下回收磁珠，这种方法
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