第二章 应用实时荧光PCR筛选玉米转基因品系
2.2.2 实验试剂与耗材
表2.2实验室试剂与耗材
Table 2.2 laboratory reagents and consumables
型号
名称 200次 Ex TaqDNA聚合酶
200次
ROX Reference Dye Ⅱ
1ml
离心管
2ml
离心管
0.2 ml
八连管
10μl、100μl、1000μl
微量移液器
型号
名称
200次
Ex TaqDNA聚合酶 生产厂家 TAKARA公司 TAKARA公司 QIAGEN 公司 QIAGEN 公司 ABI公司 德国普兰德 生产厂家 TAKARA公司
外源基因：启动子CaMV35S、Ubi，终止子NOS，筛选基因NPTⅡ（新霉素磷酸转移酶），PAT(修饰的草丁磷乙酰转移酶)，ZEIN（玉米内源基因），玉米品系基因MON810、Bt11、T25、CBH351、GA21、MON863、NK603、TCl507、59122、MIR604、MIRl62、DP98140、3272、TCl507以及转基因植物阳性样品为本实验室保存。
2.3 两种试剂盒的提取方法以及效率比较
2.3.1 提取方法
2.3.1.1 离心柱法（TIANGEN）
1.处理材料：取50mg研磨粉碎的原料放入2ml离心管中，向其中加入320μl缓冲液GA，加入20μl蛋白酶K和340μl缓冲液GB，充分混匀，震荡，65℃孵育30min。 2.12000r/min离心2min，取440μl上清至新管中。 3向上清中加入220μl无水乙醇，充分混匀6-8次。
4.将上一步所得的溶液和絮状沉淀全部加入一个吸附柱CB3中，12000r/min，离心2min,倒掉废液。
5向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD，12000r/min离心30sec，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中。
6 向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW，12000r/min 离心30sec，倒掉废液，将吸附
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第二章 应用实时荧光PCR筛选玉米转基因品系
柱CB3放入收集管中。
7 向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12000/min 离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
8 将吸附柱CB3放回收集管中，12000r/min，离心2min，倒掉废液将吸附柱CB3开盖置于室温放置数分钟，以彻底晒干其中的吸附液。
9 将吸附柱CB3 放回一个干净的离心管中，向吸附膜的中间悬空滴加60μl洗脱缓冲液TE,室温放置5min，12000rpm离心2min。 2.3.1.2 离心柱法（TAKARA）
1.取50ng 研磨后的样品加入到tube管中，加入500μl的Buffer HS Ⅱ和10μl RNase，于56℃水浴孵育10min。
2 加入62.5μl的Buffer KAC，充分混匀，冰上放置5min，12000rpm 离心5min，取上清，加入与其等体积的GB，充分混匀。
3 将吸附柱安置于收集管中，溶液移于吸附柱中，12000rpm离心1min，弃滤液。 4 将500μl Buffer WB加入到吸附柱中，12000rpm离心1min，弃滤液 5 将700μl Buffer WB加入到吸附柱中，12000rpm离心1min，弃滤液 6将吸附柱CB3放回收集管中，12000r/min，离心2min
7将吸附柱CB3 放回一个干净的离心管中，向吸附膜的中间悬空滴加40μl 洗脱缓冲液TE,室温放置5min，12000rpm离心2min洗脱DNA。 2.3.2玉米样品DNA浓度的测定
用Evolution-3000紫外可见分光光度计，测定玉米样品A260、A280，并平行测量三次，取计算出样品的DNA平均浓度值。
2.4 实时荧光PCR反应
本研究以四种转基因玉米为材料，针对现有的十七种玉米品系，利用ABI公司的实时荧光PCR仪7500和VIIA两种仪器进行PCR扩增，比较其特异性及灵敏度实验，从而建立一套系统、完整的转基因玉米品系的PCR检测方法。相关转基因玉米品系的引物探针序列见表3.1，序列来自参考文献[51]。
表2.3实时荧光PCR检测转基因玉米品系的探针和引物序列
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第二章 应用实时荧光PCR筛选玉米转基因品系
Table 2.3 probe and primer sequences are real-time PCR detection of transgenic maize lines
品系引物和探针引物序列 TC1507
NK603 MON810
MON89034
59122
GA21 MIR604
Btll
3272
Probe Primer-F Primer-R Probe Primer-F Primer-R Probe Primer-F Primer-R Probe Primer-F Primer-R Probe Primer-F Primer-R
Probe Primer-F Primer-R Probe Primer-F Primer-R Probe Primer-F
Probe Primer一F Primer-R Probe Primer一F Primer-R Primer-R
Probe Primer一F Primer-R
5’-FAM-TAACTCAAGGCCCTCACTCCG-TAMRA-3' 5’-TAGTCTTCGGCCAGAATGG-3' 5’-CTTTGCCAAGATCAAGCG-3'
5’-FAM-CCGCGTTAACAAGCTTACTCGAGGTCATTC-TAMRA-3' 5’-CGGCCAGCAAGCCTTGTA-3' 5’-TCCCGACTCTCTTCTCAAGCA-3'
5’-FAM-ACGAAGGACTCTAACGTTTAACATCCTTTGCCA-TAMRA-3' 5’-CCTTCATAACCTTCGCCCG-3' 5’-AATAAAGTGACAGATAGCTGGGCA-3' 5’-FAM-ATCCCCGGAAATTATGTT-MGB-3' 5’-TTCTCCATATTGACCATCATACTCATT-3' 5’-CGGTATCTATAATACCGTGGTTTTTAAA-3'
5'-FAM-TTTAAACTGAAGGCGGGAAACGACAA-TAMRA-3' 5’-GGGATAAGCAAGTAAAAGCGCTC-3' 5’-CCTTAATTCTCCGCTCATGATCAG-3'
5’一FAM一CATATACTAACTCATATCTCTTTCTCAACAGCAGG-TAMRA-3'
5’一FAM一CTTATCGTTATGCTATTTGCAACTTTAGA一3'
5’一TGGCTCGCGATCCTCCT一3'
5’一FAM一AGGCGGGAAACGACAATCTGATCATG一TAMRA一3' 5’一GCGCACGCAATTCAACAG一3'
5’一GGTCATAACGTGACTCCCTTAATTCT一3'
5’一FAM一TATCCGCTCATGGAGGGATTCTTGGA一TAMRA一3'
5’一GCGGAACCCCTATAAAGTTTA一3'
5’一FAM一ACTGCTGACGCGGCCAAACACTG一TAMRA一3'
5’一TCATCAGACCAGATTCTCTTTTTTATGG一3'
5’一CGTTTCCCGCCTTCAGTTTA一3'
5’一FAM一AGACTCC'1'1'1'1'CGGGAGCGATTCATC一TAMRA一3'
5’一GCGCGGTGTCATCTATGTTA一3'
5’一ACAACGGGGAGTTGTATGCT一3'
5’一CAAGAAATGGTCTCCACCAAA一3'
5’一FAM一TCTCGGTGACGGGCAGGACC一TAMRA一3'
5’一GACTTCAGCCTGCCGGTACT一3'
5’一GTGCATCAATGGAGGAGAGAAC一3' CBH351
BT176
续表
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第二章 应用实时荧光PCR筛选玉米转基因品系
5’一FAM一CAATGGCGGAACGACTCAAT一TAMRA一3'
5’一GCTACGACATGATACTCCTTCCA一3'
5’一AATTGCCCTTTGGTCTTCTGAGA一3'
5’一FAM一TCACTATGCTCTGCTCTATAGGGAGACCGAATT一TAMRA一3'
5’一GAAATAAATTGTTCTGATTTTGAGTGCAA一3'
5’一ATATGATACAACCATATCTAAATGGAACTTT一3'
5’一FAM一ACTGCTGACGCGGCCAAACACTG一TAMRA一3'
5’一TCATCAGACCAGATTCTCTTTTTTATGG一3'
5’一CGTTTCCCGCCTTCAGTTTA一3'
5’一FAM一AGACTCC'1'1'1'1'CGGGAGCGATTCATC一TAMRA一3'
5’一GCGCGGTGTCATCTATGTTA一3'
5’一ACAACGGGGAGTTGTATGCT一3'
T25 MON863
3272
Probe Primer一F Primer-R Probe Primer一F Primer-R Probe Primer一F Primer-R Probe Primer一F Primer-R
CBH351
所选用方法在依据我国出入境检验检疫行业标准SN/T1196-2003《玉米种转基因成分定性PCR检测方法》，研究了一种新的实验室方法，并通过了认证。
反应体系为：Premix Ex taq（2x） 12.5 ul，Rox Reference Dye Ⅱ 0.5 ul，上游引物、下游引物各1ul，ddH2O水8ul，模板2 ul，反应体系共25ul。并设计PCR反应试剂空白对照（以水代替DNA）、阴性对照和阳性对照。
实时荧光PCR反应在ABI Prime 7500 定量PCR检测仪上进行，反应参数为95℃预变性1min；95℃变性34sec，60℃退火15sec，40个循环。
2.5结果与讨论
2.5.1不同加工程度玉米DNA浓度测定结果
在提取时间上上来看，使用天根植物组DNA提取试剂盒提取DNA时，大约需要1h30min;使用宝生物植物DNA提取试剂盒提取DNA时需1h；宝生物的试剂盒比较节省时间。使用紫外分光光度计测量基因组DNA在260nm和280nm处的紫外吸收值OD260和OD280，平行测量三次取平均值，计算出的四种不同产品的平均OD260/OD280值，并比较两种试剂盒的提取时间，见表2.4至2.7。
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第二章 应用实时荧光PCR筛选玉米转基因品系
表2.4 未加工玉米6743 DNA的纯度
Table 2.4 unprocessed maize 6743 DNA purity
提取方法 OD 1.77 离心柱法 1.78 （TIANGEN）
1.77 离心柱法
（TAKARA）
1.86 1.85 1.88
平均OD
1.77
1.87
通过表2.4，我们发现TAKARA植物基因组试剂盒提取的6743号玉米DNA的纯度要好TIANGEN植物基因组DNA提取试剂盒。
表2.5粗加工玉米碎颗粒7167
Table 2.5 roughing crushed corn granules 7167
提取方法 OD 1.79 离心柱法 1.78 （TIANGEN）
1.77 离心柱法
（TAKARA）
1.83 1.81 1.82
平均OD
1.78
1.82
通过表2.5，我们发现TAKARA植物基因组试剂盒提取的7167号玉米DNA的纯
度要好于TIANGEN植物基因组DNA提取试剂盒。
表2.6精加工玉米粉6979
Table 2.6 finishing cornmeal 6979
提取方法 OD 1.91 离心柱法 1.92 （TIANGEN）
1.93 离心柱法
（TAKARA）
1.89 1.87 1.88
平均OD
1.92
1.88
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