第一章 绪论
基因芯片的测序原理图
1.4.1.2基因芯片技术分类
按照芯片的功能不同可以将芯片分成两种：测序芯片和表达芯片[38]。基因表达芯片可以将数以万计的基因检测探针固定在一块DNA基质膜上，对来源于不同的个体、不同发展周期的细胞内mRNA或反转录后产生的cDNA进行检测，它能够进行综合不同阶段的分析和判断，加快这些病理基因的确定[39]。
另外基因芯片根据探针的类型不同也可分为两类：cDNA微阵列和寡核苷酸芯片；根据应用范围的不同而分为专用芯片、P53基因检测芯片、病毒检测芯片等[40]。
1.4.1.3基因芯片技术的发展现状
目前，基因芯片技术发展迅速。在20世纪末期，转基因番茄—作为世界上第一个转基因植物产品在进人市场后，转基因农作物以一种迅速的发展模式席卷全球。20世纪末期美国投入了将近20亿美元科研经费用于研究基因芯片这项技术。紧接着，世界各国看到了基因芯片技术的巨大发展前景，也纷纷开始研究基因芯片，将基因芯片列为主要发展的产业正在全球崛起，目前生物芯片的产值十分可观，近几年达到了10亿美元左右，据估计生物芯片的工业产值在五年后将达到200亿美元 [41]。基因芯片技术把百万甚至千万个与生命相关的基因片段通过微加工工艺固定在面积极小的芯片上，它可以对生命科学与医学中的各种生物化学反应过程进行集成，它的出现将给众多的科学领域带来巨大的变革。
1.4.1.4基因芯片技术的应用 1.4.1.4.1在食品微生物检测中的应用
基因芯片技术在检测微生物方面应用十分强大[42]，它能够一次性的检测出全部存在的病原微生物，并且能够检测特定致病菌株的所有遗传学指标。与传统的检测手段，比如说生化实验、血清实验等相比，基因芯片在微生物领域具有以下优势:①高通量且并行检测②操作时间短，方法简洁，整个过程大概需要4h，大大缩减了检测时间③与传统方
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法相比，灵敏度提高[43]。Volokh等[44]应用基因芯片鉴定了6种李斯特菌;Call等[45]通过研究E.coli 0157:H7的志贺样毒素I . II及溶rfn.素A，证实了基因芯片技术在检测这种大肠杆菌分离物方面十分准确; 陈昱等[46]提供了一种基因芯片和多重PCR技术相结合的检测方法，该方法在检验沙门氏菌、志贺氏菌、肠致病性大肠杆菌O157方面十分准确、快速，且灵敏度比较高。 Keraamas等[47]利用基因芯片检测并鉴定了2种十分相近的大肠弯曲杆菌和空肠弯曲杆菌（两种菌均来自鸡粪便中），对今后禽流感病毒的防备和治愈方面大为有益。
1.4.1.4.2在转基因食品检测中的应用
因为短期内关于转基因食品是否安全并没有一个明确的结论，并且消费者有权知道
所购食品是否具有转基因成分，各个国家大体上都采取了转基因食品的―说明标签‖制。但是，某些不法商家为了谋取利益，经常违背这项规定。对于这样的情况，政府和企业的各检测部门都十分需要一种能够精确检测食品中转基因成分的手段。但从目前的PCR扩增法，无论是单重还是多重PCR检测只能对其中几种转基因成分进行检测，耗费时间长、效率低，当食品中有大量转基因成分时，不能进行快速检测。而基因芯片将大量的探针固定于其表面，单做1个实验就可以筛选出大量的不同转基因成分，因而基因芯片技术被认为是在检测转基因成分中最具潜力的手段之一。Rudi等[48]制作了一种及基因芯片用来检验玉米中转基因的含量，结果表明在7份待检产品中，主要包含了Bt176. Bt11. Mon 810. T25. GA21. CBH351和DBT418等七种转基因品系，其中1份样品检出含有玉米品系基因GA21。与常规的转基因检测方法相比，其检测限为0.10%-2.0%，因而此系统被认为可适用于将来基因修饰生物genetically modified organisms检测的需要。成小薇等[53]通过PCR对样品核酸进行扩增，将扩增产物与固定于可视芯片的特异性探针进行杂交分析，优化了芯片杂交的温度和时间，结果证明了芯片的特异性和重复性都较好，该芯片可以同时检测大豆、水稻、小麦、玉米、油菜等不同植物的转基因成分，且反应的灵敏度可达0.1％。张广远等[49]根据定性PCR的扩增靶序列设计40bp大小的基因芯片探针，建立了上述MIR162、MON88017、MON89788、18S rRNA和MON88017、MS1、RF1、18S rRNA等7种转基因品系基因芯片检测方法，结果证实了该方法的反应灵敏度较高(0.01%)。
1.4.1.5 基因芯片存在问题与展望
基因芯片技术的应用前景十分光明，但在实际检测中，仍有各种问题函待解决，
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包括:①基因芯片技术在设计探针时，需要知道很多的己知道碱基序列的DNA或cDNA片段的序列，而目前来看，由于基因片段插入的不确定性，很难检测出未知的核苷酸片段;②芯片制作的工艺比较复杂，需要高精度的制备和专门的仪器设备来检测信号源，制取费用很高，一般实验室不能承受该费用;③由于芯片的质量控制标准也没有统一的标准，造成芯片的制备也十分复杂。技术本身也存在一些问题，大致可概括为(1基因探针与靶DNA之间的的杂交出现问题：未配或错配;(2)靶DNA会形成复杂的空间结构;(3)计算机对靶DNA的重复序列识别模糊;（5)由于芯片技术的高科技型，在共享数据和资料库等方面还不够完善，基因芯片的种类和数目还比较少。在食品检测中以上这些原因都在不同程度上影响了基因芯片技术的发展。
1.5 本实验研究的主要目的和意义
本论文对不同加工程度的玉米基因组DNA的提取纯度进行了分析，然后针对四种不同加工程度的转基因玉米（未加工产品、粗加工产品、精加工产品以及深加工产品），建立了PCR和基因芯片两种检测方法，为一合理选择快速、简便、高效的基因组DNA提取、浓度测定以及转基因品系检测方法提供参考。主要研究内容包括以下几个方面: (1)以四种转基因玉米种子为材料，比较2种常用的植物基因组DNA提取试剂盒，通过紫外分光光度检测，对提取得到的基因组DNA的纯度及两种试剂盒的提取时间进行分析。
(2)比较ABI公司的两台实时荧光PCR仪（ABI 7500和ABI viia 7）进行分析，结合两种不同试剂盒提取的DNA进行实时荧光PCR反应，分析四种不同加工程度玉米品系的检测情况。
(3) 利用基因芯片技术对四种不同加工程度的玉米产品进行扩增，分析比较和实时荧光PCR反应对玉米品系的检出率。
(4)根据实时荧光PCR及基因芯片技术原理以及检出情况，提出一套完整、检出率更高的、更有效地检测玉米中转基因品系的方法，并对玉米中个别品系进行特异性分析。 (5)特异性产品：干酵母中转基因成分的检测以及按照优化的DNA提取试剂盒进行DNA提取，以及用实时荧光PCR技术和基因芯片技术进行品系鉴定。
(6) 薯格中转基因成分和品系检测。
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第二章 应用实时荧光PCR筛选玉米转基因品系
第二章 应用实时荧光PCR筛选玉米转基因品系
为了确保植物组DNA的后续检测中实时荧光PCR和基因芯片反应能够进行，我们需要大致的了解DNA的纯度。本研究以玉米标准品为基准，玉米种子为材料，采用2种常用的植物基因组DNA提取试剂盒提取四种转基因玉米产品（深加工玉米产品：玉米酒槽粕，轻度深加工产品：粉碎玉米粉，粗加工产品：粉碎玉米粒；未加工玉米：玉米颗粒）基因组DNA，对比不同方法提取的基因组DNA纯度及提取时间;各基因组DNA经ABI公司的荧光PCR7500和VIIA扩增，通过各样品的扩增曲线以及Ct值分析各样品的品系筛选情况；
2.1 实验材料
样品为送入辽宁省出入境检验检疫局的四种转基因玉米：玉米酒槽粕4504、粉碎玉米粉6979、粉碎玉米粒7167、玉米粒6743；待检薯格1864。
2.2 实验仪器与试剂
2.2.1 实验仪器
表2.1 主要使用仪器
Tab 2.1 The main use of the instrument
型号 名称 2-16P 台式高速离心机
legend micro 172
漩涡振荡器
721
紫外分光光度计
7500
实时荧光PCR仪
VIIA 7
荧光定量PCR仪
TZL-1004
八连管搅拌套
DHZ-3
恒温水浴箱
12
生产厂家 德国Sigma 德国IKA
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