生物化学实验指导
温州医学院检验医学院、生命科学学院
2011年3月
目录
第一部分 生物化学常用技术及原理
一、常用生物材料的处理 二、生物化学实验中一些基本操作
第二部分 实验记录报告及实验设计简介
一、实验记录 二、实验报告 三、实验设计简介
第三部分 实验
实验一 血清白蛋白的分离与纯化 实验二 蛋白质的醋酸纤维薄膜电泳 实验三 SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量 实验四 等电聚焦电泳法测定蛋白质等电点 实验五 双缩脲法测定血清蛋白质量 实验六 考马斯亮兰法测定血清蛋白质 实验七 酵母细胞核酸的提取、鉴定 实验八 淀粉酶的动力学实验 实验九 碱性磷酸酶米氏常数的测定 实验十 乳酸脱氢酶同工酶分离及鉴定 实验十一 葡萄糖耐量试验 实验十二 Folin-吴法测定血糖
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第一部分 生物化学实验常用技术及原理
一、常用生物材料的处理
在生物化学实验中，无论是分析组织中各种物质的含量，或是探索组织中的物质代谢过程，皆需利用特定的生物样品。由于实验的特殊要求，往往需要将获得的样品预先做适当处理。掌握此种实验样品的正确处理与制备方法是做好系列化实验的先决条件。
基础系列化实验中，最常用的人体或动物样品是全血、血清、血浆及无蛋白血滤液。有时也采尿液做实验。组织样品则常用肝、肾、胰、胃粘膜或肌肉等组织制成组织糜、组织匀浆、组织切片或组织浸出液等，常用于各种生化实验。
关于这些样品的制备方法，扼要介绍如下： 1、血液
全血 无论收集动物或人体血液时，一方面要注意仪器的清洁与干燥，另一方面要及时加入适当的抗凝固。一般在血液取出后，迅速盛于含有抗凝剂的试管内，同时轻轻摇动，使血液与抗凝剂充分混合，以免形成凝血小块。取得的全血如不立即进行试验，应储存于冰箱中。
常用的抗凝剂有草酸盐、柠檬酸盐、氟化钠或肝素等，可视实验要求而定。一般情况下，用廉价的草酸盐即可，但在测定血钙时不适用。氟化钠可做为测定血糖时的良好抗凝剂，因其兼有抑制糖酵解的作用，以免血糖分解。但氟化钠也能抑制脲酶，故用脲酶测定尿素时不能用。肝素虽好，但价格较贵，尚不能普通应用。
抗凝剂用量不应过多，以免影响实验结果。通常每毫升加1-2mg草酸盐或5mg柠檬酸钠或5-10mg氟化钠，肝素仅需要0.01-0.02mg，最好将抗凝剂制成适当浓度的水溶剂，然后取0.5ml置于准备盛血的试管中，再横放蒸干（肝素不宜超过30℃），则抗凝剂在管壁上形成一层薄膜，使用时较为方便，效果也好。
血浆 上述抗凝的全血在离心机中离心，则血球下沉，上清液即为血浆。如需应用血浆分析，必须严格防止溶血，故要求采取血液时一切用具（注射器、针头、试管等）皆需清洁干燥，取出血液也不能剧烈振摇。
血清 收集的血液不加抗凝剂，在室温下约5-20分钟即自行凝固，通常经3小时，血块收缩而分出血清。为促使血清分出，必要时可离心分离，或置37℃水浴中，这样可缩短时间，并取得较多的血清。
制备血清也要防止溶血，一方面仪器要干燥，另一方面，血块收缩后，及早分离出血清，因为放置过久，血块中血球也可能溶血。
无蛋白血滤液 许多系列化分析要避免蛋白质的干扰，往往先将其中蛋白质沉淀然后去除，制成无蛋白血滤液。如血液中的非蛋白氮、尿酸、肌酸等测定需先把血液制成无蛋白血滤液后，再进行分析测定。蛋白质沉淀剂如钨酸，三氯醋酸或氢氧化锌皆可用于制备无蛋白血滤液，可根据不同的需要而加以选择。
血液样品的保存 血液成分容易发生变动，原则上应尽快进行分析。如必须暂保存时，应放入冰箱。全血最不稳定，可做成除蛋白滤液保存。血浆应及时与血细胞分离，血清也应与凝块分开，单独保存。
2、尿液 （1）采尿
尿液成分及浓度生理变动较大。按实验目的不同，可用不同的尿液。许多定性实验可用随时采取的一次尿样。清晨第一次尿样，比较稳定，便于比较，也常采用。为定量实验常需采用全日尿样。
全日尿亦即由第一天某时开始到第二天同一时间的24小时尿，具体采法如下：在第一
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天晨6时排尿一次弃去以后的尿液全部收集到加有适当防腐剂的容器中，到次晨6时，不论有无尿意，再计尿量多者应另有准备。采尿中间不可有异物混入。采尿完了后，把全部尿液充分混匀，最后记录总体积及其他必要项目，然后留取一部分供实验用。
（2）防腐
为防止采尿过程中及暂保存中尿液成分变化，需要加适当的防腐剂。选用不影响实验目的的防腐剂。常用的有甲苯，全日尿中加2-5ml，它成一薄层盖在尿液表面上，适用于一般测定。另外，也常用冰醋酸（约10ml）、浓盐酸（约10ml）等。
3．组织
根据实验目的不同则选用组织和处理方法亦不同。许多实验中常用肝脏或肌肉，这是因为其量多且含酶类较全，尤其肝脏代谢机能广泛，且其组织易于处理，是最常选用的材料。组织材料的处理过程中最重要的原则 是勿使待分析物质发生变化或损失。
（1）动物的处理
一般常用兔、鼠、蛙等，可用打击头部使急速死亡。鼠亦常用脱颈椎方法致死，必要时立即断头放血。然后迅速采出所需组织，尽可能在冰冷条件下，除去其他组织，洗去血液，用滤纸吸干，称重供用。
（2）匀浆的制备
进行组织或细胞内酶活性的测定或某些成分的定量时，多使用组织匀浆。制备匀浆一般常用研钵。把组织剪碎，放研钵中，（必要时加少量玻璃砂）研磨，加入一定量液体以做成一定稀释倍数的匀浆（如10%匀浆，即指匀浆中含组织湿重10%）。但研磨中一次加入较多液体，不便于细研，可先加少量。研细后，最后加入全量研匀。
为制备匀浆并提取组织成分，常用的溶液有生理盐水、缓冲液等。在分析某些细胞成分时使用0.15M的KCl或0.25M蔗糖液等。有时为使蛋白沉淀并提取某些成分，用5~10%三氯醋酸等。
在分析酶活性或某些易变物质（如ATP等）分离细胞内各组分进行研究时，特别要注意保持冰冷条件，迅速处理。制备匀浆中，一方面采取冷却手段，防止变化。另外也可改进方法加速操作。为此，可采用匀浆器（Homogenizer），使用电动匀浆器不仅加快了研磨速度，也提高了匀浆的均匀程度。
常用的装置是通过小电动机转动的玻璃匀浆器，匀浆管内放组织及提取液，其杵上接电动机，杵壁与管壁间有一定间隙，杵底有磨齿，杵转动时把组织撕开并在杵壁与管壁间磨碎，且管迅速上下移动，可使组织相继通过与管壁摩擦被磨碎。研磨效果与间隙及转速有关。匀浆管外面可放冰等，在冷却条件下研磨。
二、系列化实验中一些基本操作
生物化学实验中除了有一些特殊的操作和方法使用某些特殊仪器外，整个实验的绝大部分是由各种常用的基本操作组成的。而基本操作的掌握是否正确和熟练往往是决定实验成败的关键。因此在每一次实验中均应注意基本操作是否正确，并且应有意识地加强这方面的练习。下面是生化实验中的一些基本操作。
系统化实验中操作技术与一般化学实验大致相同，这里不仅将系列化实验室中经常要作用到的一些基本操作法温习如下：
（一）玻璃仪器的洗涤：
只有使用清洁的仪器和实验材料才能免除杂质的污染，从而得到符合实验的实验结果。各种不同性质的实验，要求清洁程度各不一样，比如：一般定性的实验对仪器的清洁要求，只要仪器表面不含有干扰本实验的杂质就行；定时分析的实验要求严格得多，应达到不影响分析结果；至于观察酶活性的实验、作代谢研究的实验，仪器的清洁要求更严格，要防止微量杂质（如某些离子、重金属化合物、细菌代谢产物等）的干扰。
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1、一般定性、定量实验所用的玻璃敞口仪器如试管、离心管、烧杯、烧瓶等的洗涤，可先作蘸有肥皂或合成洗涤剂的手刷擦洗，对表面有牢固地附着的污染物的玻璃仪器可用去污粉擦洗。某些难除去的污物应针对其化学本质采用相应的清除法，如以上方法去除不干净，可根据具体情况试用热的碱溶液洗 。用浓盐酸可先去除附着在器壁上的某些氧化物、碳酸盐、铁锈等，然后用自来水冲洗干净，最后用少量去离子水或蒸馏水淋洗内壁三次即可。洗 干净的玻璃仪器对着光看，其表面应是光洁的，淋洗的水成片的从仪器上流下来，不应有水珠附在内壁。
2、精密的容量仪器，如量瓶、滴定管、吸管等的洗涤，其要求是洗去杂质同时清除附在容器表面的微量油污，以使试液在容器内壁能光滑地流下，不形成液滴挂在容器内壁上，不致造成读数错误。洗涤容量分析器应尽可能不使内壁与硬器接触，以免造成器壁擦伤使容量不准。洗涤时一般可水洗，或用一些合成洗涤剂，经水冲洗后尽量沥干。然后置浓的铬酸洗液中浸泡15分钟以上，利用铬酸洗液的强氧化性除去器壁上附有的微量油污（这种微量油污可以是从空气中飘来的），然后将铬酸洗液倒回贮器中以备下次再用。经洗液浸过的仪器再用大量的自来水冲洗，最后用去离子水或蒸馏水洗三次备用。大的容量分析仪器如量瓶、滴定管等不能浸在洗液中，可将洗液灌入容器中，如洗液量较少可经常倾侧容器使洗液浸湿器壁即可达到去油污的效果。
使用铬酸洗液清洁容器应注意以下几点：（1）水可使洗液中的硫酸被稀释以致铬酸析出同时洗液的氧化力下降，甚至失效，因此用铬酸洗液时待洗的容器应尽量沥干。（2）Hg2+、Ba2+、Pb2+等离子与铬酸洗液作用可生成不溶的化合物沉积在器壁上，因此凡接触过含有此等化合物的容器应先除去这些离子（可和硝酸、EDTA钠等先行清除），用水冲洗后再用铬酸洗液洗。（3）有机化合物、油类、有机溶剂均可使铬酸洗液还原失效，因此器壁如附有大量油类，有机物等，应先除去然后再用铬酸洗液。（4）铬酸洗液有很强的酸性和氧化性、皮肤衣服接触到即可致损伤毁坏，使用时应仔细，以免造成损失。（5）铬酸洗液还原为硫酸铬时，洗液由原来的深棕色变为绿色，此时洗液不具有氧化性，不能继续使用。
滴定管的洗涤与吸管的洗涤要领基本相似。
塑料器皿（如洗瓶、塑料试剂瓶、塑料离心管等）一般不宜用试管刷刷洗，以免擦伤。 附：铬酸洗液的配制法：取K2Cr2O7（工业用或试剂四级）3克，置一容积150ml以上的烧杯中，加入冷水10ml。将烧杯置火焰上徐徐加热至沸，冷却后K2Cr2O7可又部份重新结晶析出。用量筒取比重1.84的浓硫酸（工业用）100ml，慢慢沿烧杯壁加入，一边加一边用玻璃捧搅动，如发热很猛应暂停加酸继续搅拌，待浓硫酸全部加入时应得到棕褐色浓稠的洗液。冷却后倒入洗液瓶（大口试剂瓶）中加盖保存备用。
3．酶学实验和代谢研究实验所用的玻璃仪器清洁要求很严，要特别注意微量重金属离子、细菌和细菌代谢物的干扰，仪器可用硝酸、盐酸多次反复洗涤，然后用去离子水或蒸馏水（某些要求特别严的实验需用重蒸馏水，甚至三蒸馏水）洗涤，洗净的仪器应及时烘干，必要时需经灭菌，然后妥善保存以免污染。对使用过的仪器的应养成及时洗的习惯，特别是血液分析时用的血液样本的吸管，用过后应当立即用水将所沾的血液冲去否则放置过久，血液干燥硬结，就很不容易清除。
（二）玻璃仪器的干燥：
一般的玻璃仪器均可于洗净后倒置架上，让其水分蒸发自然干燥，如需迅速干燥者应按仪器的不同类型按下棕不同方法处理：
试管、离心管、烧杯、烧瓶等普通器皿可置烘箱中100~105℃烘烤，如同时需灭菌者可升至180℃以上烘烤，少量仪器如需急用也可在电炉上或酒精灯上烘烤。烘烤时应将器皿时时转动，务使受热缓慢且均习，并将管口（或杯口）倾斜向下，以便水蒸气凝成水滴，顺口流出，不致使水滴接触烘热了的器壁而使仪器爆裂。使用电吹风干燥一般玻璃仪器也很便利
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