操作：
一、安装垂直板型电泳装置
此种夹心式垂直板电泳装置（如图4中2-8，2-9）的两侧为有机玻璃制成的电极槽，两个电极槽中间夹有一个凝胶模子。凝胶模子由3部分组成：一个“U”形的硅胶框、两块长短不等的玻璃片、样品槽模板（俗称“梳子”）。电机槽由上贮槽（白金电极在上或面对短玻璃片）、下贮槽（白金电极在下或面对长玻璃片）和冷凝系统组成。凝胶模子的硅胶框内侧有两条凹槽，可将两块相应大小的玻璃片嵌入槽内。玻璃片之间形成一个2~3mm厚的间隙，将来制胶时，将胶灌入其中。灌胶前，先将玻璃片洗净、晾干、嵌入胶带凹槽中。长玻璃片下沿与胶带框底之间保持有一缝隙，以使此端的凝胶与一侧的电极槽相通；而短玻璃片的下沿则插入橡胶框的底槽内。将已插好玻璃片的凝胶模子置于仰放的上贮槽上，短玻璃片应面对上贮槽，再合上下贮槽，用4条长螺丝将两个半槽固定在一起。上螺丝时，要按一定顺序逐个拧紧，均匀用力。将装好的电泳装置垂直放置，在长玻璃片下端与硅胶框交界的缝隙内加入用电极缓冲溶液配制的1%琼脂糖溶液，待其凝固后，即堵住凝胶模板下面的窄缝（通电时又可作为盐桥）。
图4 夹心式垂直板电泳装置
二、凝胶的制备 1、分离胶的制备
根据所测蛋白质的相对分子质量范围，选择某一合适的分离胶浓度。按表3-2所列的试剂用量配制。
表3-2 SDS-不连续系统不同浓度凝胶配制用量表
贮液 凝胶贮液
分离胶缓冲溶液 凝胶贮液
配制30ml不同浓度的分离胶液所需试剂用量表 配制10ml
浓缩胶（3%） 7% 10% 12% 15% 20% 7 7.5 —
10 7.5 —
12 7.5 —
15 7.5 —
20 7.5 —
1.0
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浓缩胶缓冲溶液 蒸馏水
— 15
— 12
— 10
— 7
— —
1.3 6.5
10% SDS溶液 TEMED溶液
0.3 0.02
0.3 0.02
0.3 0.02
0.3 0.02
0.3 0.02
0.1 0.02
以上溶液混合后抽气10分钟
10%过硫酸铵溶液
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.1
将所配制的凝胶液沿着凝胶的长玻璃片的内面用细长头的滴管加至长、短玻璃片的窄缝内，加胶高度距样品槽模板下缘约2cm。用滴管沿玻璃片内壁加一层蒸馏水（用于隔绝空气，使胶面平整），约30~60分钟凝胶完全聚合，用滴管吸去分离胶胶面的水封层，并用无毛边的滤纸条吸去残留的水液。
2、浓缩胶的制备
按表2-6配制浓缩胶，混匀后用细长头的滴管将凝胶溶液加到已聚合的分离胶上方，直至距短玻璃片上缘1cm处，轻轻将“梳子”插入浓缩胶内（插入“梳子”的目的是使胶液聚合后，在凝胶顶部形成数个相互隔开的凹槽）。约30分钟后凝胶聚合，再放置30分钟。小心拔去“梳子”，用窄条滤纸吸去样品凹槽内多余的水分。
三、蛋白质样品的处理 1、标准蛋白质样品的处理
称标准蛋白质样品各1mg左右，分别转移至带塞的小试管中，按1.0 ~ 1.5g/L溶液比例，向样品加入“样品溶解液”，溶解后轻轻盖上盖子（不要盖紧，以免加热时迸出），在100℃沸水浴中保温2~3分钟，取出冷至室温。如处理好的样品暂时不用，可放在－20℃冰箱保存较长时间。使用前在100℃水中加热3分钟，以除去可能出现的亚稳态聚合物。
2、待测蛋白质样品的处理
固体样品的处理与标准蛋白质相同。如待测样品已在溶液中，可先配制“浓样品溶解液”（各种溶质的浓度均比“样品溶解液”高1倍），将待测液与“浓样品溶解液”等体积混匀，然后同上加热。如待测液太稀可事先浓缩，若盐量太高则需先透析。
四、加样
将pH=8.3电极缓冲溶液倒入上、下贮槽中，应没过短玻璃片。用微量注射器依次在各个样品凹槽内加样，一般加样体积为10~15μl。如样品较稀，可加20~30μl。由于样品溶解液中含有比重较大的甘油，故样品溶液会自动沉降在凝胶表面形成样品层。
五、电泳
将上槽接负极，下槽接正极，打开电源，开始时将电流控制在15~20mA，待样品进入分离胶后，改为30~50 mA。待蓝色染料迁移多至下端约2cm时，停止电泳，约需5~6小时。
六、剥胶和固定
取下凝胶模子，将凝胶片取出，滑入一白瓷盘或大培养皿内，在染料区带的中心插入细铜丝作为标志。加入固定液（应没过凝胶片），固定2小时或过夜。
七、染色
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倾出固定液，加入染色液。染色过夜。 八、脱色
染色完毕，倾出染色液，加入脱色液。数小时换一次脱色液，直至背景清晰，约需一昼夜。
九、Mr的计算
通常以相对迁移率（mr）来表示迁移率。相对迁移率的计算方法如下： 用直尺分别量出样品区带中心及铜丝与凝胶顶端的距离（如图5），按下式计算： 相对迁移率（mr）=样品迁移距离（cm）/染料迁移距离（cm）。
以标准蛋白质相对分子质量的对数对相对迁移率作衅，得到标准曲线（如图3）。根据待测样品的相对迁移率，从标准曲线上查出其相对分子质量。
图5 标准蛋白质在SDS-凝胶上的分离示意图 a 样品迁移距离b染料迁移距离 1细胞色素c 2胰凝乳蛋白酶原A 3胃蛋白酶 4卵清蛋白 5牛血清清蛋白
注意事项：
一、市售化学纯SDS需重结晶后使用。 SDS的重结晶方法如下：称20g SDS，放入500ml圆底烧瓶中，加入半匙活性炭和300ml无水乙醇，摇匀。烧瓶上接一个小冷凝管，在沸水浴中回流5小时以后，用热过滤漏斗趁热滤除不溶物，滤液应透明无色。将滤液冷至室温后放冰箱过夜，次日用预冷的布氏漏斗抽滤，用少量预冷的乙醚（分析纯）淋洗两次，然后再将其置真空干燥或40℃以下烘箱中烘干。
二、在用SDS-PAGE测定蛋白质的相对分子质量时，每次测定样品必须同时作标准曲线，而不能用上一次电泳的标准曲线。
三、凝胶浓度的选择：根据待测样品估计的相对分子质量，选择凝胶浓度。Mr在25000~200000的蛋白质选用终浓度为5%的凝胶；Mr在10000~70000的蛋白质选用15%的凝胶；在此范围内样品的相对分子质量的对数与迁移率呈直线关系。
四、一些由亚基或两条以上肽链组成的蛋白质，它们在SDS及巯基乙醇作用下，解离成亚基或单条肽链。故对这些蛋白质，SDS-PAGE测定结果只是亚基单条肽链的Mr。须用其他方法测定其Mr及分子中肽链的数目。
五、SDS-PAGE对电荷异常（如组蛋白F1）或构象异常的蛋白质、带有较大辅基的蛋白质（如糖蛋白）以及一些结构蛋白（如胶原蛋白）等测出的相对分子质量不太可靠。因此要确定某种蛋白质的相对分子质量，最好用2种测定方法互相验证。
六、氧气会与被激活的单体自由基作用，从而抑制聚合过程，因此在加激活剂前对单体溶液最好用真空泵或水泵抽气。
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七、用琼脂糖封底及灌入凝胶时不能有气泡，以免影响电泳时电流的通过。
八、凝胶聚合后，必须放置30分钟至1小时，使其充分“老化”后才能轻轻取出样品槽模板，切勿破坏加样凹槽底部的平整，以免电泳后区带扭曲。
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实验四 用等电聚焦电泳法测定蛋白质等电点
目的：
掌握等电聚焦电泳法测定蛋白质等电点的原理和方法。 原理：
等电聚焦法是一种特殊的凝胶电泳法。它的特点是在凝胶柱中加入一种称为两性电解质载体（ampholine）的化合物，从而使凝胶柱上产生pH值梯度。将蛋白质放在这种凝胶柱中进行电泳，带电荷的蛋白质离子即在柱上泳动。当泳动至凝胶的某一部分、而此部位的pH值正好相当于该蛋白质的等电点时，由于蛋白质的净电荷为零即不再移动（聚焦），测定聚集部位凝胶的pH值，即得知该蛋白质的等电点。
由此可见，两性电解质载体犹如隔离离子，可把具有不同等电点的两性电解质，分隔在相应的pH区域中。
一般电泳法，由于扩散作用的影响，随着电泳时间或电泳质点移动距离的延长，区带愈来愈宽，分辨率较差。等电聚焦法抵消了扩散作用的影响，电泳时间的延长，反使区带愈是狭窄（所测物质愈集中），因而提高了分辨率。
利用等电聚焦法，不仅可测两性电解质的等电点，亦可将具有不同等电点的物质分离。 目前常用的等电聚焦胶支持的介质有：聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶和葡聚糖凝胶。聚丙烯酰胺凝胶是等电聚焦电泳分析中最广泛使用的一种支持物。等电聚焦电泳的方式有很多种，大致可分为垂直管式、毛细管式、水平板式及超薄水平板式等，这些方式各具其优点，本实验采用垂直管式。
器材：
1、圆盘电泳槽 2、直流电源 3、小玻璃管 4、微量注射器 5、普通注射器 6、洗耳球 7、直尺 8、刀片 9、试管 10、培养皿 11、移液器 12、烧杯 试剂：
1、两性电解质载体凝胶：丙烯酰胺3.5g，N-甲叉丙烯酰胺（Bis）0.1g，pH3—10两性电解质载体2.5ml，加水至50ml。
2、10%过硫酸铵溶液： 0.1g过硫酸铵溶于1ml的双蒸水中，临用前配制，当日使用。 3、蛋白质溶液：纯牛血清蛋白7mg，溶于1ml蒸馏水。此蛋白溶液应无盐离子，否则应透析去盐。
4、5%磷酸溶液：将29.4ml 85%磷酸加水稀释至500ml。
5、2%氢氧化钠溶液：10g NaOH，溶于蒸馏水并稀释至500ml。
6、考马斯亮蓝R250染色液：考马斯亮蓝R-250 0.25g，加入50%甲醇91ml和冰醋酸9ml。
7、40%蔗糖溶液：蔗糖4g溶于少量蒸馏水，稀释至10ml。
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