研工作者的天赋与才华，所以说实验设计在一定意义上是一门专门的学科，各自然学科都有各自的实验设计的特殊性，以下仅介绍初学者进行生化实验设计的一些基本知识。
系列化实验设计包括选题、方法的确定、实验的具体设计（包括对照组设立，随机的原则和平行的原则等），预实验、正式实验、实验资料的统计分析，总结与论文撰写等。这里仅就选题与实验的具体设计加以介绍。
（一）选题首先要考虑该题是否具有理论意义和经济实用意义，其次要查清该题是否新颖的。若属前人从未涉足的，开拓性课题，当然是最好的，若是前人已经从事过的，但广度或深度还有待发展，在前人研究的基础上能加以创新或更新的，也应该说是新颖，而且这一部分课题是大量的。为此，在选题的同时就必须充分查阅文献，例如：化学文摘（CA），生物学文摘（BA）等有关文献，以免机械重复别人的工作，劳而无功。
在此基础上，就可以进行此课题的可行性研究，如经费，实验试剂，器材、动物、方法技术、人员配套等。特别是生化实验，要考虑到一些重要的工具酶，放射性同位素和特殊试剂；有些在理论上很常见，很简单，但实际上供应都很困难，而且相当昂贵，有的甚至保存条件苛刻，保管期有限。这些因素都要经常进行充分调查，做到心中有数，不然将给实验带来许多意外的困难，造成骑虎难下，进退维谷的局面。
对于初学者，应选择一个易于成功的题目，可以积累经验，增强信心。 （二）实验方法和技术的确定
方法与技术有许多种。选择的原则是根据课题的需要，只要能达到要求，一般选用简单的、经济的、现有的。每一种方法和技术都有其缺点，应当正确地认识，并使用之。
（三）实验具体设计
由于生化实验的对象是活体或生物大（小）分子，尤其在进行整体实验时，其种系间、个体间差异不少，因此使实验复杂化了。为了获得正确的实验结果，应注意如下三原则：
（1）对照的原则
没有对照组的生物学实验的结论其可信性较小，从设计上讲是有缺陷的。对照组不仅应有正常对照，而且要应用特殊对照，如假处理对照或假手术对照等，正如系列化实验比色时应有空白对照及某些试剂对照一样。尤其在以人为研究对象时，更应注意语言、暗示等各种心理因素的影响。可以使用单盲（实验者不清楚）或双盲（受试者、实验者均不清楚）条件下进行，以使实验数据更接近真实。
（2）平行的原则
由于生物体个体差异较大，因此，只能做较大数量的样本比较，才能取到接近实际的结论。但样本又不可能无限的多，因人力、物力、时间上均无法承受，样本的数目允许要多少，要由课题的性质所决定。一般可根据预实验的结果，用统计处理，达到统计学的要求（如<0.05等），即可估算出正式实验的样本数。
（3）随机的原则
实验对象要随机分组，决不能按主观意志将实验对象进行分组。后者人为的不公平分组将造成假象，且无法重复实验结果，不是科学的态度。随机往往采用抽签方式进行。
（四）预实验
预实验的目的是检验实验方法是否可行，试剂、仪器是否合理，设计是否合理，是摸索最佳实验条件的阶段，通过修改和完善，即可正式确定实验方法与操作。预实验的数据一般不宜并入实验结果。
（五）正式实验（略） （六）实验数据分析
数据间总有差距，上下波动，如何评价它们，可使性如何，应作如下考虑： （1）这些数据解释问题是否合理，是否符合本实验的原定设计目的。
11
（2）误差。
为了判断误差，可从精确度（准确度与精密度二个指标）来观察之。还应从生物统计方法进行评价，具体的详见生物统计学。
12
第三部分 实验
实验一 血清白蛋白的分离与纯化
目的
1、了解血清蛋白质分离的一般方法。
2、掌握盐析法、凝胶层析和DEAE-纤维素层析法分离纯化白蛋白的方法。 原理
不同蛋白质的相对分子质量、溶解度以及在一定条件下带电的情况有所不同，可根据这些性质的差别，分离及提纯各种蛋白质。
本实验先用盐析法初步分离。在半饱和硫酸铵溶液中，血清白蛋白不沉淀，球蛋白沉淀，离心后白蛋白主要在上清液中。
凝胶层析也称凝胶过滤、凝胶过滤层析、分子排阻层析和分子筛层析。凝胶是具有一定孔径的网状结构物质，凝胶层析是一种分子筛效应，主要用于分离分子大小不同的生物大分子以及测定其相对分子质量（Mr）。相对分子质量小的物质可通过凝胶网孔进入凝胶颗粒的内部，而相对分子质量大的物质不能进入凝胶内部，被排阻在凝胶颗粒之外，随着洗脱的进行，相对分子质量小的物质由于进入凝胶内部，不断地从一个网孔穿到另一个网孔，这样“绕道”而移动，走的路程长，下来得慢（迁移速度慢），而相对分子质量大的物质因不能进入凝胶内部即随洗脱液从凝胶颗粒之间的空隙挤落下来，走的路短，下来得快（迁移速度快），这样就可达到分离的目的。由于血清白蛋白的相对分子质量较硫酸铵大得多，故盐析初步分离的白蛋白可用凝胶层析法除去硫酸铵，并且可进一步分离纯化。
表17 不同类型的葡聚糖凝胶的分离范围和应用
凝胶类型 （Sephadex）
G-10 G-15 G-25 G-50 G-75 G-100 G-150 G-200
分离范围（Mr） 肽或球状蛋白质
<700 <1500 1000~5000 1500~30000 3000~70000 4000~150000 5000~400000 5000~800000
应用 去盐 去盐 去盐 小分子蛋白质分离 中等蛋白质分离 中等蛋白质分离 较大蛋白质分离 较大蛋白质分离
除去硫酸铵后的白蛋白溶液在0.02mol/L pH 6.5醋酸铵（NH4Ac）缓冲液的条件下，加到二乙氨乙基（DEAE）-纤维素层析柱上，在此pH时，DEAE-纤维素带有正电荷：
C HC H 纤维素—O—CH —CH —NH纤维素—O—CH —CH —NC H+ HC H
25++2522222525 13
它能吸附带负电荷的白蛋白、α及β球蛋白（血清白蛋白等电点为4.9，绝大多数α及β球蛋白等电点均小于6）。改用0.06mol/L NH4Ac，离子交换柱上的β—球蛋白及部分α—球蛋白可被洗脱下来。继而将盐浓度提高至0.3mol/L NH4Ac，则白蛋白被洗脱下来，此时收集的即为较纯的白蛋白（尚混有少量α-球蛋白）。
器材 1、层析柱1cm×40cm（×1）， 1cm×70cm（×1），1cm×20cm（×1）。 2、离心机（4000r/min）。 3、离心管。 4、恒流泵。 5、部分收集器。 6、梯度混合器。 7、冷冻干燥机。 8、pH计 试剂
1、0.5mol/L pH6.5醋酸铵缓冲液（简写为NH4Ac）：称取醋酸铵38.55g，加蒸馏水约80ml溶解，在不断搅拌下滴入稀氨水或稀醋酸溶液，用pH计准确调节至pH6.5，再加蒸馏水至1000ml。
2、0.06mol/L pH6.5 NH4Ac缓冲液：取试剂1用蒸馏水稀释8.33倍。 3、0.02mol/L pH6.5 NH4Ac缓冲液：取试剂2用蒸馏水稀释3倍。
上述三种缓冲液必须准确配制，并用pH计准确调整pH，用蒸馏水稀释后应再用pH计测定pH值。由于NH4Ac是挥发性盐类，故溶液配制时不得加热，配好后必须密封保存，以防pH和浓度发生改变，否则将影响所分离的蛋白质纯度。
4、饱和硫酸铵溶液。
5、血清样品（或其他粗蛋白样品）为样品Ⅰ。 操作
1、硫酸铵盐析
取2.0ml血清于离心管中边摇边慢慢滴入饱和硫酸铵溶液2.0ml，混匀后室温放置10min，离心（3000r/min）10min。用滴管小心吸出上层清液于另一试管中（尽量全部吸出）为样品Ⅱ，作为纯化白蛋白之用。
2、凝胶柱层析除盐
（1）装葡萄糖凝胶G-25（Sephadex G-25）层析柱：取一根1cm×40cm的层析柱垂直夹于铁架上（有尼龙网孔的一头朝下），将底部夹紧，注入2cm高的0.02mol/L pH6.5 NH4Ac缓冲液。将已处理好浸泡在0.02mol/L pH6.5 NH4Ac缓冲液中的Sephadex G-25葡聚糖凝胶搅成悬浮状，加入层析柱内，慢慢打开底部出口，同时不断加入凝胶直至柱高25cm（装柱时速度要均匀，不能分层，不得有气泡，凝胶床表面要平整）。
（2）平衡：在凝胶柱床上留有3cm高的溶液，将层析柱两头旋紧，接上恒流泵，用0.02mol/L pH6.5 NH4Ac缓冲液平衡20min（流速为1ml/min，层析柱两头要旋紧，防止柱床流干）。
（3）洗脱：葡聚糖凝胶G-25层析柱经0.02mol/L pH6.5 NH4Ac缓冲液平衡后，旋下上盖，慢慢打开底口使凝胶床上的液面下降到与床面相齐（不能低于凝胶床面），夹死底口。用长滴管吸取经盐析所得的样品Ⅱ，小心缓慢地加到凝胶床面上。打开底口，使样品Ⅱ慢慢进入凝胶床直至与床表面相齐。吸取0.5ml 0.02mol/L pH6.5 NH4Ac缓冲液，沿柱壁慢慢加入凝胶床面上，慢慢打开底口使其流至与床面相齐（三次）以洗下柱壁上的白蛋白。继续在
14
凝胶床面上加3cm高的洗脱液，旋紧层析柱两头，接上恒流泵（或者手工操作），用0.02mol/L pH6.5 NH4Ac洗脱（流速为1ml/min）。
（4）收集：洗脱液用部分收集器收集（或者手工操作），每管2ml（每2min收集一管）。用紫外检测仪检测蛋白峰（280nm），收集为样品Ⅲ。绘制洗脱曲线。
（5）测定：分别取高峰管、高峰后管各2滴至白色的平皿中，分别与加入2滴的双缩脲试剂、BaCl2 试剂反应，观察结果。
3、凝胶柱层析分离纯化
（1）装葡萄糖凝胶G-75/100（Sephadex G-75/100）层析柱：取一根1cm×70cm的层析柱，同2法装柱、平衡、洗脱、收集。此步得到样品Ⅳ。绘制洗脱曲线。
4、离子交换层析分离白蛋白
（1）装DEAE-纤维素离子交换层析柱：取一根1cm×20cm的层析柱垂直夹在铁架上，注入1cm高的0.02mol/L pH6.5 NH4Ac缓冲液。将已处理好浸泡在0.02mol/L pH6.5 缓冲液中的DEAE-纤维素搅成悬浮状（沉淀的纤维素与NH4Ac溶液体积比为1:2），加入层析柱内，慢慢打开底部出口，同时不断加入DEAE-纤维素直至柱高10cm。
（2）平衡：纤维素柱床上留有3cm高的溶液，将层析柱两头旋紧，接上恒流泵（或者手工操作），用0.02mol/L pH6.5 NH4Ac缓冲液平衡20min（流速为1ml/min，层析柱两头要旋紧，防止柱床流干）。
（3）洗脱：
DEAE-纤维素离子交换层析柱经0.02mol/L pH6.5 NH4Ac缓冲液平衡后，旋下上塞，慢慢打开底口使纤维素床上的液面下降到与床面相齐，夹住底口。将样品Ⅳ加到纤维素柱上，打开底口使样品Ⅳ慢慢进入床体，直至与床面相齐，吸1.0ml 0.02mol/L pH6.5 NH4Ac溶液，沿柱壁慢慢加入纤维素床面上（三次，操作同上），洗净沾在柱壁上的白蛋白液。在纤维素床面上加3cm高的0.02mol/L pH6.5 NH4Ac溶液，将层析柱两头柱塞旋紧，接上恒流泵（或者手工操作），用0.06~0.5mol/L pH6.5 NH4Ac进行梯度洗脱（流速为1ml/min）。I室加入0.06mol/L pH6.5 NH4Ac溶液200ml，II室加入0.5mol/L pH6.5 NH4Ac溶液200ml（图2）。
图2 梯度洗脱装置
15