（4）收集：洗脱液用部分收集器收集（或者手工操作），每管2ml（每2min收集一管）。经紫外检测仪检测蛋白峰（280nm），收集到的纯化白蛋白为样品Ⅴ，记录体积，留作醋酸纤维薄膜电泳法检查其纯度，分析得率及测定其相对分子质量之用。绘制洗脱曲线。
注：待测血清为样品Ⅰ
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实验二 血清蛋白质的醋酸纤维薄膜电泳
目的：
1、掌握醋纤薄膜电泳的原理及操作。
2、定量测定人血清中各种蛋白质的相对百分含量。 原理：
血清中各种蛋白质在pH8.6的缓冲液中都带有负离子，由于它们带电量，分子量和分子形状等不同，在一定的实验条件下（如电场强度、缓冲液离子强度及pH值），因电泳速度不同被分离成数个区带。
血清中各种蛋白质可以被氨基墨10B染色，各区带中蛋白质经染色后，可洗脱比色定量。
器材： 1、电泳仪 2、1.5×10cm醋酸纤维素薄膜 3、剪刀 4、平头颞子 5、沙利氏吸管 6、15×15mm试管 7、10ml刻度吸管 8、721分光光度计 试剂：
1、比妥缓冲液（pH8.6，离子强度0.06）： 2、染色液：
氨基黑10B：0.5g 甲醇：50ml 冰醋酸：10ml 蒸馏水：40ml
3、漂洗液：甲醇或乙醇45ml，冰醋酸5ml，蒸馏水50ml 4、洗脱液： 0.4M NaOH
5、透明液：冰醋酸25ml，95%乙醇75ml 6、新鲜血清 操作：
1、取1.5-2cm宽、8cm长的小条CAM，预先在加样位置用铅笔作一记号，然后将有光泽向下漂浮于缓冲液上浸泡5-10分钟（也可预先浸泡随时取用），待膜完全浸透后，取出轻轻夹于滤纸中，吸去多余的溶液，然后在无光泽面上距顶端约1.5~2cm处用较细而尖端光滑的微量吸管或玻片加血清约2~3μl，待血清吸入膜后，以无光泽面向下两端紧贴在四层的滤纸桥上（加血清的一端贴在电泳槽阴极端），加盖，平衡2~3分钟，然后通电（连续电泳时，每次注意极相的转换）。
2、电泳：
电压：约110~140V（或相当于电场强度10V/cm） 电流：0.4~0.6mA/cm宽（约5~6mA） 时间：40~60分钟] 3、染色
电泳完毕后，关闭电源将膜取出，直接浸于染色液中3-5分钟，然后取出用漂洗液浸洗脱色，至背景完全无色为止。
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4、定量：
将漂洗后的膜夹于滤纸中吸干，剪下各蛋白区带及一小段未着色的空白区，分别浸入5毫升洗脱液中，振摇数次，37℃放置10分钟比色，用580~620nm波长，以空白区管调正吸光度到0点读记各蛋白质的吸光度值。
吸光度总和（T）=A+α1+α2+β+γ
A清蛋白%=
α1球蛋白%=
α2球蛋白%=
β球蛋白%=
γ球蛋白%=
A×100 T?1T×100
?2T×100
?T×100
?T×100
5、正常值：A：60~70%，α1：2~3.5%，α2：4~7%，β：9~11%，γ：12~18% 6、透明保存：
在玻片上滴加透明液3-4滴，将漂洗后晾干的膜平铺在上面并迅速展平，放置过夜或37℃温箱烘干，然后在约40℃温水中浸泡3-5分钟，即可将此透明的染有兰色区带图的膜揭起。夹在滤纸中，待吸干后即可保存或用吸收光度计直接测定各区的吸光度。
注：容易产生的几种现象：
1、电泳谱不齐：点样时血清滴加不整齐。
2、电泳图谱出现条痕：点样后薄膜过干，或由于电泳槽密闭性不良，或电流过大造成水蒸发薄膜干燥。
3、分离不良：标本滴加过多。
4、区带拖尾：缓冲液离子强度小于0.05。
5、区带过于紧密：缓冲液离子强度小于0.075。
6、染色后清蛋白中间色浅：染色时间不足，或清蛋白分量过高时可减少检测样品的用量或延长染色时间。
7、向γ球蛋白的方向移动：系电渗现象，可升高点端的缓冲液面高度，或适当加大电流量来克服。
8、透明时若膜不干或透明液中醋酸含量不足膜即发白，不能完全透明；若透明液中醋酸含量过高，或室温过高，可使膜溶解，此时可酌情减少醋酸含量。
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实验三 SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量
目的：
1、掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理。
2、掌握SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量的原理。 原理：
聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高分辨率，用它分离、检测蛋白质混合样品，主要是根据各蛋白质组分的分子大小和形状以及所带净电荷多少等因素所造成的电泳迁移率间的差别。1967年，Shapiro等人发现，在聚丙烯酰胺凝脱中加入十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate，SDS）后，与SDS结合的蛋白质带有一致的负电荷，电泳时其迁移速率主要取决于它的Mr（相对分子质量），而与所带电荷与形状无关。
当蛋白质的Mr在15000~200000之间时，蛋白质的Mr与电泳迁移率间的关系可用下式表示：
lgMr=K-bm，
式中，Mr为蛋白质的相对分子质量。m为迁移率；b为斜率；K为截距。在条件一定时，b和K均为常数。
将已知相对分子质量的标准蛋白质的迁移率对Mr的对数作图，可得到一条标准曲线（如图3）。将未知相对分子质量的蛋白质样品，在相同的条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率可在标准曲线上查得它的相对分子质量。
图3 37种蛋白质的Mr对数与电泳相对迁移率关系图
（Mr范围为11000~70000，10%凝胶，pH=7.2，SDS-磷酸盐缓冲系统）
SDS是一种阴离子型去污剂，在蛋白质溶解液中加入SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇可使蛋白质分子中的二硫键还原；SDS能使蛋白质的非共价键（氢键、疏水键）打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数和蛋白质与SDS结合比为1.4g SDS/g蛋白质），形成蛋白质-SDS复合物。由于SDS带有大量负电荷，当它与蛋白质结合时，所带的负电荷的量大大超过了蛋白分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差异。
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SDS与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的改变。蛋白质-SDS复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形的长椭圆棒。不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样，而长轴则随蛋白质相对分子质量的大小成正比地变化。这样的蛋白质-SDS复合物在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只是椭圆棒的长度，也就是蛋白质相对分子质量的函数。
SDS-PAGE缓冲系统有连续系统和不连续系统。不连续SDS-PAGE缓冲系统有较好的浓缩效应，近年趋向用不连续SDS-PAGE缓冲系统。按所制成的凝胶形状又有垂直板型电泳和垂直柱型电泳。本实验采用SDS-不连续系统垂直板型凝胶电泳测定蛋白质的相对分子质量。
器材：
1、垂直板型电泳槽
2、直流稳压电源（电压300~600V，电流50~100mA） 3、50或100μL的微量注射器 试剂：
1、 标准蛋白质纯品：根据待测蛋白质的相对分子质量大小，选择4~6种已知相对分子
质量的蛋白质纯品作为标准蛋白质。本实验采用的标准蛋白质见表3-1所示。
表3-1 5种标准蛋白质的相对分子质量
标准蛋白质 细胞色素c 胰凝乳蛋白酶原A 胃蛋白酶 卵清蛋白 牛血清清蛋白
来源 马心或酵母 牛胰 猪胃 鸡卵 牛血清
相对分子质量（道尔顿）
12500 25000 35000 43000 67000
2、1%（V/V）TEMED溶液：取1ml TEMED，加蒸馏水至100ml，置于棕色瓶中，在4℃冰箱中保存。
3、10%（W/V）过硫酸铵溶液：取过硫酸铵1g，溶解于10ml蒸馏水中。最好当天配制。
4、0.05mol/L，pH=8.0 Tris-HCl缓冲溶液1g：称取Tris0.61g，加入50ml蒸馏水使之溶解，再加入3ml 1 mol/L HCl溶液，混匀后在pH计上调pH至8.0，最后加蒸馏水定容至100ml。
5、蛋白质样品溶解液：SDS 100mg，巯基乙醇0.1ml，甘油1.0ml，溴酚蓝2mg，Tris-HCl缓冲溶液2ml，加蒸馏水至总体积10ml。
6、分离缓冲溶液：Tris 36.3g，加入1 mol/L HCl溶液48.0ml，再加蒸馏水到100ml，pH=8.9。 7、浓缩胶缓冲溶液：Tris 5.98g，加1mol/L HCl溶液48.0ml，加蒸馏水到100ml，pH=6.7。 8、凝胶贮液：凝胶贮液：Acr 30.0g，Bis 0.8g，加蒸留水到100ml
9、电极缓冲溶液：SDS 1g，Tris 6g，甘氨酸28.8g，加蒸馏水至1000 ml，pH=8.3 10、固定液： 50%甲醇454ml，冰醋酸46ml，混匀。
11、染色液：1.25 g考马斯亮蓝R-250，加454ml 50%甲醇溶液和46ml冰醋酸，混匀。 12、脱色液：冰醋酸100ml，无水乙醇300ml，加蒸馏水600ml。
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