8、12%三氯醋酸溶液：12g三氯醋酸，溶于100ml蒸馏水。 9、脱色液：V（乙醇）：V（冰醋酸）：V（蒸馏水）=25:10:65。 10、TEMED（N，N，N′，N′-四甲基乙二胺）。 操作：
1、取4ml两性电解质载体凝胶，置于梨形瓶中，加入0.07ml白蛋白（7mg白蛋白/ml），轻轻摇匀，抽去气泡。加入TEMED 5μl和10%过硫酸铵溶液25μl，将溶液迅速混匀。
2、取内径0.5cm，长10cm干净玻璃管两支，垂直放置，底端塞以橡皮塞，加入40%蔗糖溶液3-4滴，然后吸取梨形瓶中的两性电解质载体凝胶-白蛋白混合液1.8ml缓缓放入玻璃管，上部再加蒸馏水2-3滴，使混合液表面水平并与空气隔绝，室温放置凝聚约1h。
3、管内凝胶凝聚后，用滤纸将顶端水吸去，拔去管底橡皮塞，使蔗糖液流出，并用少量蒸馏水洗，然后将玻璃管放入圆盘电泳装置，上槽注以5%磷酸溶液，接正极；下槽注以2%NaOH溶液，接负极，150V，聚焦约3h。
4、聚焦结束，取出玻璃管，用水将两端洗净。用注射器吸水，并将针头紧贴玻璃管内壁插至凝胶与管壁之间，沿管壁转一周，同时注入少量水，使凝胶与玻璃管分离。然后用洗耳球将凝胶柱轻轻压出，浸于12%三氯醋酸中固定2h，白色蛋白区带即出现，再浸于考马斯蓝染色液中37℃染色0.5h，取出转移至脱色液中脱去背景颜色。
将另一做同样样品的凝胶柱的两端用水洗净，用同样方法剥离，挤出，顺序切成0.5cm长的小段，各浸泡1.0ml蒸馏水过夜，测pH值。
5、以凝胶柱长度（mm）为横坐标，pH值为纵坐标作图，量出染色的各蛋白区带距离，对照曲线查出等电点。
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实验五 双缩脲法测定血清总蛋白
目的：
掌握双缩脲法测定蛋白质的原理 原理：
蛋白质中的肽键（-CO-NH-）在碱性溶液中能与2价铜离子作用生成稳定的紫红色络合物。此反应和两个尿素分子缩合生成的双缩脲（H2N-OC-NH-CO-NH2）在碱性溶液中与铜离子作用形成紫红色的反应相似，故称之为双缩脲反应。这种紫红色络合物在540nm处的吸光度与蛋白质的含量在一定范围内成正比关系，经与同样处理的蛋白质标准液比较，即可求得蛋白质含量。
仪器：
1、721分光光度计
2、微量进样器、移液器 3、恒温水浴箱 试剂：
1、6mol/L NaOH溶液 称取NaOH 240g，溶于新鲜制备的蒸馏水（或刚煮沸冷却的去离子水）约800ml中，冷却后稀释至1L，贮于有盖塑料瓶中。若用非新开瓶的NaOH，须先配成饱和溶液，静置2周左右，使碳酸盐沉淀，其上清饱和NaOH溶液经滴定后，算出准确浓度再使用。
2、双缩脲试剂 称取硫酸铜结晶（CuSO4·5H2O）3g溶于新鲜制备的蒸馏水（或刚煮沸冷却的去离子水）500m中，加入酒石酸钾钠（NaKC4H4O6·4H2O,用以结合Cu2+,防止CuO在碱性条件下沉淀）9 g和KI（防止碱性酒石酸铜自动还原并防止Cu2O的离析）5g，待完全溶解后，在搅拌下加入 6mol/L NaOH溶液100ml，并用蒸馏水稀释至1L,置塑料瓶中盖紧保存。此试剂室温下可稳定半年，若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。
3、双缩脲空白试剂 除不含硫酸铜外，其余成分与双缩脲试剂相同。
4、60-70g/L 蛋白标准液 常用牛血清白蛋白或收集混合血清（无黄疸、无溶血、乙型肝炎表面抗原阴性、肝肾功能正常的人血清），经凯氏定氮法定值，亦可用定值参考血清或标准白蛋白作标准。但定值质控血清定值准确性较差，不能用作血清总蛋白测定的标准物。
操作：
1、生化自动分析仪法，按试剂盒说明书或附录提供的参数进行操作。 2、手工操作法 取试管4支，标明测定管（U）、标准管（S）、标本空白管（B）、试剂空白管（RB），按表6-1操作。
表6-1 双缩脲法测定血清总蛋白操作步骤
加入物（ml） 血清 蛋白标准液 蒸馏水 双缩脲空白试剂 双缩脲试剂
B 0.10 — — 5.0 —
RB — — 0.10 — 5.0
S — 0.10 — — 5.0
U 0.10 — — — 5.0
混匀，置25℃30min或37℃10min，在波长540nm处比色，用蒸馏水调零，测各管吸光度。计算
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血清总蛋白（g/L）=
AU?ARB?AB×蛋白标准液浓度
AS?ARB?AB参考值 60~80g/L
3、标准曲线法：按表6-2操作
表格6-2双缩脲法测定血清总蛋白操作步骤（标准曲线法）
加入物（ml） 标准蛋白质
1 0
2*2 0.05 — 0.15 5.0
3*2 0.10 — 0.10 5.0
4*2 0.13 — 0.07 5.0
5*2 0.16 — 0.04 5.0
6*2 0.20 — 0 5.0
7*2 — 0.10 0.10 5.0
待测蛋白质 — 蒸馏水 双缩脲试剂
0.2 5.0
混匀，置25℃30min或37℃10min，在波长540nm处比色，用蒸馏水调零，测各管吸光度。用标准蛋白质量（mg）为横座标，用吸光度值A540为纵座标，作图，即得到一条标准曲线。由此标准曲线，根据测出的未知样品的A540值，即可查出未知样品的蛋白质含量。
临床意义
1、血清总蛋白浓度降低
（1）蛋白质合成障碍：当肝功能严重受损时，蛋白质合成减少，以白蛋白降低最为显著。
（2）蛋白质丢失增加：严重烧伤，大量血浆渗出；大出血；肾病综合征尿中长期丢失蛋白质；溃疡性结肠炎可从粪便中长期丢失一定量的蛋白质。
（3）营养不良或消耗增加：营养失调、低蛋白饮食、维生素缺乏症或慢性肠道疾病所引起的吸收不良，使体内缺乏合成蛋白质的原料；长期患消耗性疾病，如严重结核病、恶性肿瘤和甲状腺功能亢进等，均可导致血清总蛋白浓度降低。
（4）血浆稀释：如静脉注射过多低渗溶液或各种原因引起的水钠潴留。 2、血清总蛋白浓度增高
（1）蛋白质合成增加：大多见于多发性骨髓瘤患者，此时主要是异常球蛋白增加，使血清总蛋白增加。
（2）血浆浓缩：如急性脱水（如呕吐、腹泻、高烧等），外伤性休克（毛细血管通透性增大），慢性肾上腺皮质功能减退（尿排钠增多引起继发性失水）。
注意事项：
1、黄疸血清、严重溶血、葡聚糖、酚酞及溴磺酞钠对本法有明显干扰，故用标本空白管来消除。但如标本空白管吸光度太高，可影响测定的准确度。
2、高脂血症混浊血清会干扰比色，可采用下述方法消除：取2支具塞试管或离心管，各加待测血清0.1ml，再加蒸馏水0.5ml和丙酮10ml，塞紧并颠倒混匀10次后离心，倾去上清液，将试管倒立于滤纸上吸去残余液体。向沉淀中分别加入双缩脲试剂及双缩脲空白试剂，再进行与上述相同的其他操作和计算。
3、本法也可用于血清总蛋白浓度的标化，测定的操作步骤完全与测定标本时相同，但显色温度须控制在（25±1）℃的范围内，以及使用经过校正的高级分光光度计（波长带宽≤2nm比色杯光径准确为1.0cm）进行比色。然后再按下式计算标化结果：
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血清总蛋白（g/L）=
Au?ARB?AB5.1 ?0.2980.1式中0.298为蛋白质双缩脲络合物的吸光系数。即按Doumas双缩脲试剂的标准配方，
在上述规定的测定条件下，双缩脲反应液中蛋白质浓度为1.0g/L时的吸光度。
4、评价:双缩脲显色反应仅和蛋白质中肽键数成正比关系，与蛋白质的种类、分子量及氨基酸的组成无明显关系，各种蛋白质的显色程度基本相同；本法重复性好，RCV为4%，CCV为3.9%；线性范围为0~140g/L；本法干扰少，并且大多可以避免；使用单一的稳定试剂，操作简便、快速，既适于手工操作，也便自动化分析，已被推荐为测定血清总蛋白的参考方法。唯一的缺点是灵敏度较低，比酚试剂法低约100倍。但本法的检出限为0.2~1.7mg蛋白质/ml，这相当于70g/L的血清3~24μl，已能满足临床生化检验的需要。因此，本法是临床测定血清总蛋白质首选最方便、最实用的常规方法。
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实验六 考马斯亮兰法（Bradford法）
目的：
1、掌握考马斯亮兰法测定蛋白质的原理 原理：
1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。
考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置，由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。
Bradford法的突出优点是：
（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数。
（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。
（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。
仪器：
1、721分光光度计 2、旋涡混合器
3、微量进样器、移液器 4、恒温水浴箱 试剂：
1、标准蛋白质溶液，用γ球蛋白或牛血清清蛋白(BSA)，配制成1.0mg/ml标准蛋白质溶液。
2、考马斯亮兰G-250染料试剂：称100mg考马斯亮兰G-250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀释至1000ml。
操作：
1、标准方法
（1）具体测定按下表操作：(待测样品的加样量见下表中的第8、9、10管)
表格7-1考马斯亮兰法血清总蛋白操作步骤 加入物（ml） 1 标准蛋白质
0
2*2 0.01 — 0.09 5.0
3*2 0.02 — 0.08 5.0
4*2 0.04 — 0.06 5.0
5*2 0.06 — 0.04 5.0
6*2 0.08 — 0.02 5.0
7*2 0.10 — 0 5.0
8*2 — 0.02 0.08 5.0
9*2 — 0.04 0.06 5.0
10*2 — 0.06 0.04 5.0
待测蛋白质 — 蒸馏水 双缩脲试剂
0.1 5.0
边加边混匀，2-3分钟后，以1号管为空白对照，测定各样品在595nm处的光吸收值A595。
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