开菲尔粒发酵条件优化及冷冻干燥工艺的研究(1) - 图文(2)

中国农业大学硕士学位论文第一章绪论究课题的任务和目的。１．２国内外研究现状１．２．１开菲尔粒的结构和微生物相开菲尔粒（Ｋｅｆｉｒｇｒａｉｎｓ）是开菲尔发酵乳的发酵剂，可Ｈｊ于家庭或工业化发酵乳制品的生产。它具有不规则的外型，表面卷曲，不平整或高度丰Ｈ曲，多为粒状。还有薄片状，一般为乳白色或浅黄色，有一定的弹性和韧性，并有特殊酸味，直径多在５～１５ｍｍ不等，经多次分裂增殖，有些颗粒直径可达２０［ｒｉｍ以上。具有活性的开菲尔粒可浮在乳的表面，在乳中生长分裂，并将其特性传给ｒ一代以产生新粒。当它在乳中生长、扩大时，观察不到物性上的变化，仅看到粒由小变大，其数量的增加依赖于原粒分裂［８１。开菲尔粒的主要成分是水、黏性多糖、少量蛋白、脂质、灰分和其他成分。其中黏性多糖是乳杆菌代谢产生的胞外多糖，由葡萄糖、半乳糖以１：１的比例组成，分子最在１００万以上，具有很好的抗肿瘤效果，被命名为ｋｅｆｉｒａｎ（开菲尔多糖）。开菲尔粒的组成菌相非常复杂，有关ｋｅｆｉｒ粒微生物组成的报道很多，各报道之间差别很大。开菲尔粒中哪几种菌是开菲尔粒构成上不可缺少的菌种还未明确，此外还有许多分类学上尚难以确定的菌种。不过，这些报道也有共同点，即开菲尔粒是以乳酸菌与酵母共生关系为基础的小生态系，其构成菌相未必很固定，其菌群可能有多样的组合。这些菌经过长期的相互适应和协同作用形成了复杂的Ｉ嵩相，这些复杂的菌相使开菲尔粒形成了整体“战斗力”，能够抑制杂菌和致病菌的溢生。特有的粘多糖能够保护开非尔粒不受外界微生物侵染，像霉菌侵染不到开菲尔粒内层，它释放的酶也不能把开菲尔粒分解破坏。开菲尔粒最大的特点就是具有很强的环境适应能力和抗污染能力，正因为这些特点，使得开菲尔粒得以流传上千年。关于微生物在开菲尔粒上的分布普遍存在两种观点，一种观点认为乳糖：椎发酵型酵母在开菲尔粒的内部深层，嗜温及嗜热乳杆菌、醋酸菌聚集在开菲尔粒的表面，表面部分乳杆菌占优势，随着向内部的深入，酵母或杆菌比例逐渐加大直至酵母占绝对优势，这一观点主要是基于扫描电镜观察结果而形成的；另一观点是基于扫描电镜和透射电镜联合使用而得出的结论。开菲尔粒除具有花椰菜结构外，还具有细小薄片状、纸卷样及绕卷纸样，微生物不是无差别的随机排列在开菲尔粒上，其排列有特殊的规律和高度的序列性，其基质确由大量的纤维质碳水化合物组成。微生物栖息其上，薄片状的开菲尔粒一边较为光滑和平整，另一边高度卷曲、粗糙，显示了不对称性，酵母和短杆菌占据着高度卷曲的一面，另一面几乎全是短杆菌，在此之间的区域里有大量的弯曲欧杆菌。这两种观点的差异可能是由于选用的材料和方法不同所导致的，但他们的共同点在于都认为开菲尔粒上的微生物分布是有规律的９ｌ。目前，对开菲尔粒中的微生物进行过分离鉴定工作的国家有很多，如：德国、爱尔兰、葡萄牙、奥地利、阳班牙、阿根廷、巴基斯坦、南非、土耳其、韩国、日本等【１０】一［１８】。他们从开菲尔粒中分离山来的微生物见表１．１所示。２表１－１开菲尔粒中的微生物及特征一邀圭塑塑耋——一——±Ｓ垂型昼一一一…一…——一一Ｔａｂｌｅ１－１Ｓｉｔａｉｎｓｊ血ｋｅｆｉｌｇｒａｉｎａｎｄｉｔｓ’ｄ嗡伯ｌｃｔｅＴ．挂堑——异型发酵：Ｌｂｒｅｖｉｓ，Ｌ妇觑ｓ“ｈ口．ｒｈａｍｎｏｓ“ｓｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ，Ｌ．ｃａｓｅｉＬ．ｂｒｅｖｉｓ和Ｌ．ｋｅｆｉｒ产胞外多糖物质乳酸杆菌Ｉ司型发酵：Ｌ厶ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ，￡．ｋｅｆｗｍｏｆａｃｉｅｎｓ，Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉｓｕｂｓｐＢｕｌｇａｒｉｃｕｓ，一一————～互篁掣璺丝啦毋竺璺些二…，Ｌｃ．Ｌａｃｔｉｓ硎６叩Ｌａｃｔｉｓ，一一～…一一。…一………一一。。乳酸球菌Ｌｃｌａｃｔｉｓｓｕｂｓｐｌａｃｔｉｓｖａｒ．Ｄｉａｃｅｔｙｌａｃｔｉｓ，数量和活力都较高，发酵过程中产酸很快，酸度过高时生长受抑我国对开菲尔的关注相对较晚，只在近几年开始＊起。目前已经对民间流传的类开菲尔粒菌种如“西藏灵菇”、“雪莲菌”等进行了分离鉴定工作。北京农学院食品科学系谭锋等人从开菲尔粒中分离出２株酵母菌，弗对其在牛乳中发酵的情况进行了研究［１９１１２０ｌ；东北农业大学王亚峰等人从４个不同来源的开菲尔粒中分离得到４０株乳酸菌，并对这４０株菌进行了鉴定。结果为：德氏乳杆菌８株，德氏乳杆菌保加利亚种６株，高加索奶乳杆菌２株，嗜酸乳杆菌１株，粪肠球菌７株，屎肠球菌２株，嗜热链球菌１株，乳脂链球菌３株口１Ｉ。州北农林科技大学食品科学与工程学院的刘变芳从两藏灵菇中分离出乳酸杆菌２株，双歧杆菌１株，乳酸球菌３株，酵母菌３株口“。内蒙古乳制品研究与培训中心王和平等人从采自内蒙古锡林郭勒河流域牧区的类开非尔粒中分离出８株乳酸球菌和６株酵母菌，并鉴定乳酸球菌中２株属于明串珠菌属，３株属于片球凿属，３株属丁肠球菌属；酵母菌中４株属于可鲁维酵母属，２株属下酒香酵母属［２３］ｏ黑龙江省科学院应用微生物研究所刘宇峰等同志通过对西藏灵菇的菌体及灵菇发酵乳的宏观形态和显微形态的观察，对菌体的主要组成苗进行分离、纯化及生理生化鉴定。确定了西藏灵菇菌为耐热町鲁维酵母、亚罗可鲁维酵母为主体真菌；以乳酸杆菌、短乳杆菌和乳酸链球菌等乳酸菌为主体细菌构成的块状共生菌系。并认为两藏灵菇以酵母假丝和营养体构成茵块中心，有乳酸菌分布在菌块外周部分，共同完成复杂的牛乳发酵分解过程ｍｊ。湖南农业大学食品科技学院夏菠等人从开菲尔乳中分离出三株菌，分别为：肠球菌属坚强肠球菌、肠球菌属假鸟肠球菌种、乳杆菌属干酪乳杆菌。未分离出酵母菌，崩分离出的菌株复配发酵不能得到开菲尔奶所固３中国农业大学硕士学位论文第一章绪论有的风味口５１。由国内的研究现状来看，国内的学者开始对开菲尔这一古老而新型的发酵乳有了越来越浓的兴趣，并开始进行了科学研究。但目前为Ｉｒ所进行的工作还只集中在菌种的分离鉴定工作上，他们所使用的菌种多来源于目前流传于我国民间的菌种，被称为“西藏灵菇”，也有叫“雪莲菌”。这些来源的菌种无论从菌种形态还是微生物组成上都和开菲尔粒及其相近，可见这些菌种是开非尔粒的一个品系。１，２．２发酵条件的研究开菲尔的家庭制作方法很简单，首先将开菲尔粒放入干净的玻璃或陶瓷等耐酸器具内（约为牛奶的５％～１０％），再放入已消毒的鲜牛奶，盖上盖子，放在阴暗处，大约２４小时左右，将开菲尔粒滤出，分离出来的开菲尔放在冰箱中随时可以饮用。开菲尔的工业化生产目前主要有两种方式。一是用开菲尔粒做发酵剂；二是用复合发酵剂发酵。两种生产方式均各有利弊ｆ拍】’跚１。用开菲尔粒做发酵剂的工艺流程如图１－１所示。用驯养良好的开菲尔粒做发酵荆生产开菲尔，可以得到传统典型的开菲尔制品，即发酵制品中保留了开菲尔粒中原始的微生物种类，发酵液中微生物的代谢产物也更为丰富。缺点是，用开菲尔粒进行生产，开菲尔粒的清洗、接种计量＝＿Ｌ作不易控制，并且引入污染的风险比较大：同时由于开菲尔粒颗粒状的不规则形态以及在牛乳中的上浮特性使得这种生产方式只能小规模的生产，否则会带来发酵不均匀等问题。原料乳（３％脂肪）ｌ均质（１２．５～１７．５ＭＰａ，５５℃）ｌ原料乳（３％脂肪）Ｉ杀菌（９２。Ｃ，１５ｍｉｎ）４均质（１２．５～１７．５ＭＰａ，５５。Ｃ）Ｊ冷却（２２℃）Ｊ杀菌（９２。Ｃ，１５ｍｉｎ）ｌ接种４一开菲尔粒（３％～５％）发酵（２２。Ｃ，２２ｈ，ｐＨ＝４．７）Ｉ４冷却（２２。Ｃ）接种４一乳酸菌、酵母菌纯菌种发酵剂分装ｌ冷却、厉熟（８～１０６Ｃ，２０ｈ，ｐＩ－Ｉ＝４．５）４发酵（２２。Ｃ，１６ｈ，ｐＨ＝４．７）４分离４一开菲尔粒传统开菲尔制品４冷却、后熟（８～１０℃，１２ｈ，ｐＨ＝４．５）ｌ贮藏（４℃）分装Ｊｄ贮藏（４℃）图卜１用开菲尔粒生产开菲尔工艺流程Ｆｉｇ．１－１Ｍｅｔｈｏｄｏｆｋｅｆｉｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｗｉｔｈｋｅｆｉｒｇｒａｉｎ图卜２用纯菌种发酵剂生产开菲尔Ｆｉｇ．１－２Ｍｅｔｈｏｄｏｆｋｅｆｉｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｗｉｔｈｐｕｒｅｃｕｌｔｕｒｅｓｂｙｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌａｃｔｉｃａｃｉｄａｎｄｙｅａｓｔｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ．原料乳（３％脂肪）Ｉ均质（１２５．－－１７．５ＭＰａ，５５℃）４杀菌（９２。Ｃ，１５ｒａｉｎ）Ｉ冷却（２８℃）ｌ接种｛一乳酸菌纯菌种发酵剂乳酸发酵（２８＂Ｃ．４．５ｈ，ｐＨ＝４．７）Ｉ冷却（２０℃）４接种Ｉ一酵母菌纯菌种发酵剂分装酒精发酵（２０＂Ｃ，１６ｈ，ｐＨ＝４．３５）ｌ贮藏（４＂Ｃ）图１—３两步法纯菌种发酵剂生产开菲尔Ｆｉｇ．１－３Ｓｃｈｅｍｅｏｆｋｅｆｉｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｗｉｔｈｐｕｒｅｃｕｌｔｕｒｅｓｂｙｃｏｎｓｃｃｕｔｉｖｅｌａｃｔｉｃａｃｉｄａｎｄｙｅａｓｔｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ．用纯菌种复合发酵剂发酵的丁乞流程如图１－２、图１—３所示。其中，复合发酵剂是从开菲尔粒中分离出来的乳酸菌、酵母菌经纯种培养后再复配成混合发酵剂接种发酵（图１—２）。也有人将开菲尔的乳酸发酵和酒精发酵分两步进行，即将乳酸菌、酵母菌分两步接入牛乳中（图１－３），从而达到对发酵过程的更准确的控制。用复合发酵剂发酵，简化了生产程序及设备，同时也可以方便进行大规模的工业化生产。但是复合发酵剂的微生物组成与原始的开菲尔粒微生物组成是有很大区别的，因为到目前为止，人们还无法彻底弄清开非尔粒中的微生物种类以及它们的比例和相互关系。而用纯菌种复合发酵剂发酵是以牺牲开菲尔粒中的大量有益菌为代价的，这样发酵得到的制品在风味以及营养价值上都要逊色于用开菲尔粒发酵得到的制品，只能称为类开菲尔产品。５中国农业人学硕士学位论文第一章绪论１．２．３开菲尔成分分析及其功能作用开菲尔中参与发酵的微生物种类要比普通酸奶多，网此发酵液中的代谢产物更为丰富。（１）乳酸开菲尔中的乳酸１００％是Ｌ（＋）乳酸（右旋），普通酸奶中只有５８％是右旋，其余为Ｄｔ一）乳酸（左旋）。乳酸的两种旋光异构体具有不同生理功能，人体中缺乏Ｄ（一）乳酸代谢酶，故食剧Ｄ（－）乳酸易患酸性血液病；Ｌ（＋）乳酸可作为能源降低胃的ｐＨ值，促进蛋白质的吸收，抑制肠内病原性微生物的生长。（２）乙醇开菲尔中由于酵母的存在，使得发酵制品中有少量的乙醇。微量的乙醇可促进新陈代谢，使循环系统和神经系统的活动ＩＥ常化，对有害微生物发挥杀菌作用。（３）糖类含有乳杆菌代谢产生的胞外多糖ｋｅｆｌｒａｎ（开菲尔多糖），具有很好的抗肿瘤效果，且是目前为止难一经过小鼠口服实验证明功能性作用的微生物胞外多糖【２＂【硎；近几年研究义发现开菲尔多糖还有许多其他良好的功能性作用。如２００５年ＫａｍｉｌａＬｅｉｔｅＲｏｄｒｉｇｕｅｓ等人通过实验发现开菲尔多糖有良好的抑菌和促进皮肤愈合的作用，特别是对Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ的抑菌能力很强【”】；２００４年ＨｉｒｏａｋｉＭａｅｄａ等人研究发现开菲尔多糖可以有效降低ＳＨＲＳＰＡＩｏｓ小鼠的血压和血脂水平。当实验ＫＫＡｙ小鼠胆固醇摄入过多时，开菲尔多糖有降低血糖水平的能力。让便秘ｓＤ小鼠服用开菲尔多糖．发现小鼠粪便的水分及湿重水平均明显增加口２Ｉ。可见开菲尔多糖是开菲尔中十分重要的功能性成分。（４）脂肪酸及其它有机酸由于开菲尔中有更多种类的微生物参与发酵，使褥脂肪被降解，游离脂肪酸含最比普通酸奶含量高，使得脂肪的消化率也有所提高；同时，开菲尔中的有机酸种类也比普通酸奶多，如：醋酸、丙酸、月桂酸等，这些使得开菲尔的酸味不同于酸奶。在开菲尔中发现有四碳双羧酸，可在机体内溶解癌细胞。（５）食氮化合物开菲尔中蛋白质降解主要是由于乳酸营存径时醋酸蔼和酵母的作燃，在发酵过程中，脯氪酸、亮氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、组氨酸有显著增加。开菲尔的蛋白质降解率比普通酸奶高，因此更容易消化。（６）维生素开菲尔中的醋酸菌在代谢时合成ＶＢ２和尼克酸，酵母在发酵过程中台成ＶＢ。，ＶＢ２和ＶＢ，ｚ。酸奶在发酵过程中由丁乳酸菌代谢需要消耗尼克酸，故其含量有所下降，但开菲尔在成熟过程中酵母可以合成尼克酸，使其含量有显著增加。泛酸含量与酸奶相同也有所ｒ降，开菲尔中生扬索与鲜奶稆比基本保持不变，僵酸奶钓生物素食量｝降幅度较大。开菲尔中Ｂ曼碱含量较普通酸奶高约２倍；由于明串珠菌的作用使开菲尔中ＶＢｌ２含量增加幅度较大。Ｄｒｅｗｔｈ（１９８６）对开菲尔中叶酸变化进行了系统研究，发现新鲜开菲尔中叶酸含量为４．３ｕｇ／１００９，贮存时叶酸含量可增至６．３～９．３ｕｇ／１００９口Ｉ。（７）风味物质开菲尔中最重要的风味化合物是乙醛、丙酮、丙醛、丁：酮、戊醇、丙醇。开菲尔中的风味物质比酸奶中更复杂，２００３年，Ｄ．Ｍ．Ｂｅｓｈｋｏｖａ等人研究了开菲尔复合发酵剂中风味物质的变化规律，并发现用复合发酵剂发酵得到的风昧物质要多余用开菲尔粒发酵，通过和单菌株发酵产风味物质对比，确定了复合发酵剂中各个微生物产风味物质的类型㈨。（８）开菲尔中具体的化学成分见下表所示１３４１６