开菲尔粒发酵条件优化及冷冻干燥工艺的研究(1) - 图文(5)

中国农业大学硕士学位论文第三章开菲尔多糖分离、提取条件的选掸３．２材料与仪器３．２．１材料开菲尔粒本实验室收藏全脂纯牛奶北京三元食晶股份有限公可三氯乙酸分析纯３．２．２仪器Ｃｉｔｒａ６紫外可见分光光度计（澳大利亚ＪＢＣｌＴＧＬ－２０Ｍ高速台式冷冻离心机（湘仪离心机厂）ＤＬ－ＣＪ一２Ｎ高性能无菌实验台（哈尔滨东联电子技术开发有限公司北京分公司）ＪＹ９２－２Ｄ超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司）３．３实验方法３．３．１培养基制备将全脂纯牛奶按１００ｍ１分装至玻璃瓶中，杀菌条件：１１５。Ｃ，１５ｍｉｎ；３．３．２开菲尔粒活化将开菲尔粒按１：５０（ｍ／ｍ）比例接入灭菌牛乳中，２５℃下培养２０ｈ，活化三代后用作开菲尔发酵乳的发酵荆。３．３．３开菲尔发酵乳制备向全脂灭菌牛乳中接种５％（质量比）的开菲尔粒，在２５。Ｃ恒温培养箱中培养１２～１４ｈ，初凝后转入ＩＯ。Ｃ恒温培养箱中后酵２０ｈ。然后将开菲尔粒滤去，得到的发酵乳贮存在４＊ＣＴ备用。３．３．４开菲尔多糖分离方法取开菲尔发酵乳１０ｍｌ，加入５ｍｌ去离子水（或氯化钠溶液）．用高速冷冻离心机离心，离心条件为：离心力１５，０００Ｘｇ。温度４℃，时间２０ｍｉｎ；取上清液，向上清液中加入５％－－氯乙酸除残余蛋白质，静置１０ｒａｉｎ左右，再次离心，离心条件为：离心力２５，０００Ｘｇ，温度４℃，时间２０ｍｉｎ，弃去沉淀，向上清液中加入两倍体积无水乙醇，并将该混合液置于４℃静置过夜，１７中国农业大学硕士学位论文第三章开菲尔多糖分离、提取条件的选择再次离心，离心条件为：离心力６，０００Ｘｇ，温度４＂Ｃ，时间３０ｍｉｎ，此时得到的沉淀即为开菲尔多糖。将沉淀用去离子水溶解并定容至１００ｍｌ，用苯酚—硫酸比色法【７１丁４９０ｒｉｍ处测ＯＤ值，根据苯酚．硫酸葡萄糖标准曲线计算开菲尔多糖含量。３．３．５开菲尔多糖分离条件的选择试验方案三氯乙酸、氯化钠电解质、醇沉ｐＨ值对开菲尔多糖的分离、提纯有重要影响。分别对开菲尔多糖分离方法中（２．４）三氯乙酸添加量、氯化钠浓度以及醇沉ｐＨ值对开菲尔多糖的沉淀量的影响进行研究，试验方案设计如Ｆ。下一步分离条件的优化分别在上一步优化的基础上进行，其它步骤按开菲尔多糖分离方法进行。１、三氯乙酸添加量的确定以上清液体积为基准，取三氯乙酸的添加量分别为上清液体积的５％，１０％，１５％，２０％。２、氯化钠电解质添加氯化钠溶液，浓度分别为Ｏ．８５％，１％，２％，以去离子水为对照，添加量均为５ｍｌ。３、醇沉ｐＨ值在添加乙醇前将上清液的ｐＨ值分别调至４、５、６、７、８、９。３．３．６超声波提取法对荚膜开菲尔多糖提取率的影响比较了ＥＤＴＡ鳌合剂、超声波、加热三种处理方法对荚膜开菲尔多糖提取率的影响。首先将开菲尔发酵乳中的胞外开菲尔多糖去除，去除方法为：取开菲尔发酵乳１０ｍｌ，加入２％ＮａＣＩ溶液５ｍｌ，混合均匀，用高速冷冻离心机离心，离心条件为：离心力１５。０００×ｇ，温度４＂Ｃ，时间２０ｍｉｎ。此时，开菲尔胞外多糖溶解在上清液中，而荚膜开菲尔多糖则黏附在微生物菌体上被沉淀Ｆ来。弃去上清液，将得到的沉淀分别做如Ｆ处理：表３－１荚腹开菲尔多糖提取条件Ｔａｂｌｅ３－１Ｅｘｌａ＇ａｃｔｉｎｇｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆｃａｐｓｕｌａｒｋｅｆｉｔａｎ按上述条件获得上清液后，分别加入两倍体积的乙醇，混匀，４＂Ｃ静置过夜，用冷冻离心机离心，离心条件为：离心力６，０００ｘｇ，温度４＂Ｃ，时间３０ｍｉｎ。将沉淀用去离子水溶解定容。用苯酚—硫酸法于４９０ｒｉｍ处比色测定ＯＤ值，根据苯酚．硫酸法测定的葡镄糖标准曲线计算开菲尔多糖的含量。以＿匕实验每组均做三次平行试验，取平均值。３．３．７蛋白质检测方法考马司亮监法中国农业大学硕士学位论文第三章开菲尔多糖分离、避取条件的选择３．３．８标准曲线的测定以葡萄糖为标样，配成１ｍｇ／Ｌ的标准溶液，分别取０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、００７ｍｇ／ｍｌ浓度用苯酚一硫酸法测定４９０ｎｍ下的ＯＤ值，得到标准曲线如Ｆ：Ｙ＝１５．２４８ｘ一０．０１０６Ｒ２＝０．９９８２３．４结果与讨论３．４．１三氯乙酸添加量对开菲尔多糖提取效果的影响牛奶中含有人量的蛋向质，经过开菲尔粒中微生物发酵后，乳中的酪蛋白大部分凝聚变性（等电点４．６），通过离心可以沉淀去脒，但烂乳清蛋白依然残留在上清液中，蚩白厦的残留会影响苯酚一硫酸比色法对多糖的测定．用三氯乙酸可以去除残余的蚩白质。三氯乙酸添加最对开菲尔多耱得率以及蛋白质去除效果如图３－２所示，由图可见，开菲尔多糖的得率随三氯乙酸添加量的增加而逐渐提高，当三氯乙酸添加量为１５％时开菲尔多糖的得率最高，继续增加三氯乙酸，开菲尔多糖的得率反而会降低；三氯乙酸添加量为ｓ％时，蛋白质残留为１。７１３１ｍｇ／Ｌ，当三氯乙酸添加量增加到１０％以上时，蛋白质残留为零，可见１０％的三氯乙酸添加量是去除残余蛋白质的最低限度。但当三氯乙酸继续增加到２０％，开菲尔多糖的测得含量反而会降低，这主要是因为二氯乙酸为强酸，添加后会降低溶液的ｐＨ值，而酸性条件Ｆ，开菲尔多糖在乙醇中的溶解度较大，因此，ＤＨ值低，开菲尔多糖的醇沉效果差。由此可见，１５％的三氯乙酸添加量最合适。皇Ⅲ一ｇ≮＿Ⅲ啪咖螂蝴粥㈣。１■■一８％【０％一工■Ｉ【５蔗２０％涮¨¨工１０：Ｌ００８５ｌ２ＴＣＡ添加量（％）ＮａＣｌ电解质溶液（％）圈３－２ＴｅＡ添加量的选择Ｆｉｇ．３—２ＳｅｌｅｃｔｉｏｎｏｆＴＣＡａｃｌｄｉｔｉｏｎ圉３－３ＮａｇＩ电解质’蕞度对ｋｅｆｉｒａｌａ分离攫取效果的影响Ｆｉｇ．３－３ＥｆｆｅｃｔｏｆＮａＣｌｃｏｎｃｃｎｔｒａｔｉｏｎＯｉｌｅｘｔｒａｃｔｉｎｇｋｅｆｉｒａｎ３．４．２氯化钠浓度对开菲尔多糖提取效果的影响氯化铺浓度对开非尔多糖提取效果的影响如幽３－３所示。开菲尔多糖是水溶性大分子物质，溶剂化能力较强，带负电荷。在酸性发酵乳体系中，微生物菌体、酪蛋向凝胶大分子等带正电荷，两者咀静电作用相结合，在高速离心时，开菲尔多糖随酪蛋Ｅ＝Ｉ等沉淀而损失。通过加入氯１９中国农业太掌硕十学位论文第三章开菲尔多糖分离、提取条件的选择化钠强电解质溶液可以削弱这种静电结合力。电解质的离子强度与电解质的浓度有关。实验结果表明，当添加２％氯化钠溶液时，开菲尔多糖的分离效果最好，开菲尔多糖的得率最高。１口口７珊伽锄蓦｜嘲。工■Ｉ。¨ｍ¨一Ｉ＿纠；２：ｌ５６７８９；｜｜；【８０ＥＤＴＡ热处理超声波ｐＨ值处理方法圈３－４ｐＨ对开菲尔多糖醇沉效果的影响Ｈｇ．３４ＥｆｆｅｃｔｏｆｐＨＯＨ图３－５荚膜多糖提取方洁比较ＭｅｔｈｏｄｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｃａｐｓｕｌａｒｋｃｆｉｒａｎｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｔｈｅｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎｑｆｋｅｆｉｒａｎＦｉｇ．３－５３．４．３ｐＨ值对开菲尔多糖醇沉效果的影响ｐＨ值对开菲尔多糖的醇沉效果如图３．４所示，可以看出ｐＨ值为７．０时开菲尔多糖的得率最高。多糖分为酸溶性多糖和碱溶性多糖两类，因此溶辕的ｐＨ值对开菲尔多糖的醇沉效果有根大影嫡。往本实验中当ｐＨ值调为串性对，开菲尔多耱在乙醇溶液中最大礞度静沉淀析出。根据以上对分离条件的优化结果。开菲尔多糖的分离方法如Ｆ：１０“开菲尔发酵乳中加入５ｍ１２％的氯化钠溶液，高速冷冻离心后取上清液，向上清液中加入１５％三氯乙酸，静置１０ｒａｉｎ左矗，再次离心，弃去沉淀，除去残余蛋白质。调整上清液中的ｐＨ值为７．０?向上清液中加入两倍体积无水乙醇，并将该混合液置于４℃静置过夜，离心得到的沉淀即为开菲尔多糖。采用以上分离方法进行开非自：多糖的提取、分离，开非尔多糖的提取量为４２７．３３ｍｇ／Ｌ，而按照优化前的方法提取开菲尔多糖，其测得含量仅为１３９．６６ｍｇ／Ｌ，开菲尔多糖的提取得率可以提高２．０６倍。３．４．４荚膜开菲尔多糖的分离效果比较由于荚骥多糖包被在菌体表面，比较难分离。本文比较了分离荚膜多糖的二种方法，结果如图３－５所示ｔ夹验结果表明，超声渡处理的效果最好，ＥＤＴＡ络合作用其次，热处理效果最差。ＥＤＴＡ是高效络合荆，能够络合钙、镁离子，添加ＥＤＴＡ可能降低英膜开菲尔多糖与微生物菌体之间的结合力；而加热处理，可使菌体蛋白变性，从而减弱荚膜开菲尔多糖与微生物菌体的结合力：超声波靠超声作用将英膜开菲尔多糖分离ｒ来。二种方法的目的均要降低英膜多中国农业大学硕士学位论文第三章开菲尔多糖分离、提取条件的选择糖与微生物菌体的结合力。根据实验结果，三种方法对于英膜开菲尔多糖的分离、提取没有明显差异，但超声波法的重现性较好。３。５本章小结１、在开菲尔多糖的分离、提取过程中，三氯乙酸添加量、氯化钠浓度、醇沉前溶液的口Ｈ值因素对开菲尔多糖的分离、提取效果有很大影响。经过实验得出，样液中添加５ｒａｌ２％的氯化钠溶液，１５％（ｍ／ｖ）添加量的三氯乙酸除残余蛋白质，提取液醇沉前口Ｈ值调为中性７．０可以使开菲尔多糖的测得含量由１３９．６６ｍｇ／Ｌ提高到４２７．３３ｍｇ／Ｌ。２、荚膜开菲尔多糖黏附在微生物菌体表面，分离提取的难度大。本章比较了ＥＤＴＡ络合剂、超声波、加热三种处理方法对荚膜开菲尔多糖的分离效果，发现没有明显差异。