开菲尔粒发酵条件优化及冷冻干燥工艺的研究(1) - 图文(6)

中国农业大学硕上学位论文第四章开菲尔粒产开菲尔多糖的发酵条件优化第四章开菲尔粒产开菲尔多糖的发酵条件优化４．１概述开菲尔多糖是开菲尔的重要功能因子，目前已经发现有良蚶的抗肿瘤、抑菌效果。因此，提高开菲尔多糖的产量不仅能改善开菲尔的产品质构，减少人工增稠剂、稳定剂的用最，同时也增加了发酵制品的功能性。ＨａｍｈｉｋｏＹｏｋｏｉ．（１９９２），Ｂ．Ｃｈｅｉｒｓｉｌｐ．（２００１），ＢｅｎｉａｒｅａｓＣｈｅｉｒｓｉｌｐ（２００３）等人先后研究过开菲尔粒中产粘菌株产胞外多糖的优化条件。他们是以从开菲尔粒中分离出的单株产粘菌株为研究对象进行优化，而开菲尔粒中的产粘菌株属丁＾嗜温型乳杆菌，其产多糖的机制受细胞内质粒的控制，质粒很容易丢失，使菌株丧失产多糖的能力，且单株乳酸菌产多糖的能力仍然是有限的。又由于产粘菌株和开菲尔粒中的微生物共生在一起时，其产粘性质会很稳定，并且由于共生菌系的协同作用，胞外多糖产量相对要高。因此，优化开菲尔粒产胞外多糖的条件更具有实际意义。胞外多糖的产量一般受温度、ｐＨ值、培养基组成等多种条件的影响，因此，本章实验通过对开菲尔生产过程中培养条件韵控制，以期找到产开菲尔多糖量高的生产Ｔ艺条件。４．２材料与仪器４．２．１材料开菲尔粒本实验室收藏全脂纯牛奶北京三元食品股份有限公司三氯乙酸分析纯４．２．２仪器Ｃｉｔｒａ６紫外可见分光光度计（澳大利亚ＪＢＱＴＧＬ－２０Ｍ高速台式冷冻离心机（湘仪离心机厂）ＤＬ－ＣＪ－２Ｎ高性能无菌实验台（哈尔滨乐联电子技术开发有限公司北京分公司）４。３开菲尔粒产开菲尔多糖的优化条件实验方案４．３．１清洗操作对开菲尔多糖产量的影响将活化好的开非尔粒从牛乳中过滤出来，并分成两部分，一部分用无菌生理盐水清洗干净，再用无菌滤纸吸干表面水份，以５％的接种虽接种至灭菌牛乳中；另一部分直接用无菌滤纸吸中国农业人学硕士学位论文第四章开菲尔粒产开菲尔多糖的发酵条件优化干表面凝乳，以５％的接种景接种至灭菌牛乳中，３０。Ｃ培养。４．３．２接种量对开菲尔多糖产量的影响将活化好的开菲尔粒从牛乳中过滤出米，用无菌生理盐水清洗掉表面凝乳，再用无菌滤纸吸于表面水份，取５％，１０％，１５％Ｚ个接种量接种至灭菌乳中，３０。Ｃ培养。４．３．３培养方式对开菲尔多糖产量的影响将活化好的开菲尔粒从牛乳中过滤山来，用无菌生理盐水清洗掉表面凝乳，再用无菌滤纸吸干表面水份，以５％的接种量接种，采用摇床培养和静置培养两种方式培养，３０。Ｃ培养。４．３．５碳源对开菲尔多糖产量的影响向牛乳中分别添加１％的乳糖、葡萄糖、蔗糖三种碳源，ｌＯＯｍｌ分装至玻璃瓶中，杀菌条件；１１５。Ｃ，１５ｍｉｎ；将活化好的开菲尔粒从牛乳中过滤出来，用无菌生理盐水清洗掉表面凝乳，再用无菌滤纸吸干表面水份，以５％的接种量分别接种，３０４Ｃ静置培养。４．３．６培养温度对开菲尔多糖产量的影响将活化好的开菲尔粒从牛乳中过滤出来，用无菌生理盐水清洗掉表面凝乳，再用无菌滤纸吸干表面水份，以５％的接种量接种，分别在２０。Ｃ，２５４Ｃ，３０６Ｃ的条件下培养。以Ｅ五个单因素实验的检测指标有：记录初凝时间，初凝ｐＨ，初凝后将开菲尔粒过滤出米，检测发酵液中乳酸菌、酵母菌、醋酸菌活菌数，将发酵液在４“Ｃ冷藏２４小时，冷藏２４小时后测ｐＨ、总酸、开菲尔多糖。４．４实验方法４．４．１培养基制备将全脂纯牛奶按１００ｍ１分装至玻璃瓶中，杀菌条件：１１５。Ｃ，１５ｍｉｎ；计数培养基乳酸菌培养基（１Ｌ）：蛋白胨ｌＯｇ、肉膏ｌＯｇ、酵母提取物５９、磷酸氢二钾２９、柠檬酸二铵２９、乙酸钠５９、葡萄糖２０９、吐温８０ｌｍｌ、七水合硫酸镁０．５８９、四水合硫酸锰０．２５９、琼脂１５９酵母菌培养基（１Ｌ）：麦芽汁１２．５Ｂｒｉｘ、琼脂１５９醋酸菌培养基（１Ｌ）：葡萄糖ｌＯＯｇ、酵母提取物１０９、琼脂１５９２３中国农业大学硕士学位论文第四章开菲尔粒产开菲尔多糖的发酵条件优化４．４．２开菲尔粒活化将开菲尔粒按１：５０（ｍ／ｍ）比例接入灭菌牛乳中，２５＂ＣＦ培养２０ｈ，活化三代后用作开菲尔发酵乳的发酵剂。４．４，３乳酸菌、酵母菌、醋酸菌活菌计数乳酸菌、酵母菌倾注法计活菌数，醋酸菌涂布法计活菌数。４．４．４ｐＨ值的测定ｐＨ计测量４．４．５总酸的检测取１０１１１ｌ发酵液于锥形瓶中，加入２０Ｉｎｌ煮沸后冷却的水，再加４滴酚酞，摇匀后，用０．１Ｎ的氢氧化钠溶液滴定至初现粉红色，并在０．５ｍｉｎ内不褪色，消耗的氢氧化钠毫升数乘１０即为酸度（。Ｔ）。４．４．６开菲尔多糖的测定取１０ＩＩＩｌ发酵乳，添加５ｍｌ２％的氯化钠电解质溶液，离－ｔＬ，分离，去除大部分蛋白质。向上清液中添加１５％的三氯乙酸（以质量为基准），进一步除去残余蛋白，再调整所得上清液的ｐＨ值为７．０，加两倍体积的乙醇，４℃静置过夜，离心，沉淀为多糖。苯酚硫酸法测得多糖浓度。４．５结果与讨论４．５．１清洗操作对开菲尔多糖产量的影响开菲尔粒具有不规则的外形，表面不平整，颗粒状，Ｆｉ色或浅黄色，具有一定的弹性和特殊酸味直释约为１０ｂ１５ｍｍ不等的菌团颗粒，主要成分有水、粘多糖、少量蛋白、脂质和其它成分。开菲尔粒最典型的微生物组成是乳酸菌、酵母菌，经过前划的菌种分离实验发现，本实验室收藏的开非尔粒中还含有相当数目的醋酸菌。这些微生物按照一定的规律分布在开菲尔粒上，并在适宜的条件下生长繁殖，从而使开菲尔粒具有繁殖性。活化好的开菲尔粒从牛乳中过滤出米后会有发酵乳残留在颗粒表面上，影响接种量的计量，因此一般通过适当的清洗操作洗掉表面的凝乳再计量接种。然而开菲尔粒上有人量的微生物是分布在颗粒表面的，因此清洗操作会将分布在颗粒表面的微生物脱落＿卜来，从而影响开非尔粒的发酵速度以及产黏性能。用清洗过的开菲尔粒和未清洗的开非尔粒接种发酵，发酵液中微生物的数目如图４．１所示，可以看出，在相同的发酵条件下，清洗后的开菲尔粒发酵得到的制品中的微生物数目略少于未清洗的开菲尔粒，但是两者在乳酸菌、酵母菌、醋酸菌三类菌的比例上没有发生改变。清洗和未清洗中国农业大学硕上学位论文第四章开菲尔粒产开菲尔多糖的发酵条件优化两种接种方式下开菲尔多糖的产量分别为１５６３．７３ｍｇ／Ｌ，１８１９．４４ｍｇ／Ｌ，即用未清洗的开菲尔粒接种，发酵液中的多糖含量略高，但总的来说，清洗操作对开菲尔粒发酵的微生物数目以及多糖产景影响不大。考虑到不清洗开菲尔粒给接种量计量上带来的困难，在后续的操作中均对开菲尔粒进行清洗。■５％●清洗下￡ｕ口１０％口１５％目未清洗。啪三曲恺避Ｓ稠■瓯ＬＡＢＹｅａｓｔ三避嶷Ｓ墟ＡＡＢＬＡＢＹｅａｓｔＡＡＢ苗的种类固｝１清洗对开菲尔中乳酸蕾、酵母蓝、醋酸菌数目的影响Ｆｉｇ．４－１Ｅｆｆｅｃｔｏｆｆｌｎｓｉｎｇ菌的种类囝４－２接种量对开菲尔中乳酸蔼、酵母菌、ｋｅｆｉｒｇｒａｉｎ０１１ｌａｃｔｉｃａｃｉｄ醋酸菌数目的影响Ｆ逗．４－２Ｅｆｆｅｃｔｏｆｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ０１１ｌａｃｔｉｃａｃｉｄｂａｃｔｅｒｉｕｍ，ｙｅａｓｔ，ａｃｅｔｉｃａｃｉｄｂａｃｔｅｒｉｕｍｍｉｃｒｏｆｌｏｒａＣＯＵ．ｔｓｏｆｋｅｆｉｒｂａｃｔｅｒｉｕｍ，ｙｅａｓｔ，ａｃｅｔｉｃａｃｉｄｂａｃｔｅｒｉｕｍｍｉｃｒｏｆｌｏｒａｃｏｕｎｔｓｏｆｋｅｆｉｒ４．５．２接种量对开菲尔多糖产量的影响不同的接种量发酵时间不同，以牛乳基本凝好为发酵终点，５％接种量发酵时间为１８ｈ，发酵终了ｐＨ值为４．３９：１０％接种量发酵时间为１５ｈ，发酵终了ｐＨ值为４．２６；１５％接种量发酵时间为ｌｌｈ，发酵终了ｐＨ值为４．２０。接种量越大发酵时间越短，同时发酵液中微生物数目也发生一定的改变，开菲尔粒接种量对发酵液中微生物数目的影响如图４．２所示，随着接种量的增人，乳酸苗数目有增加的趋势，酵母菌、醋酸菌没有明显的变化趋势。三种接种最下多糖产量分别为：１８８９．１２ｍｇ几，２４８１．１３ｍｇ／Ｌ，２３６９．４０ｍｇ／Ｌ，随着接种量的增大产黏菌株的增多，多糖产量也增高，但当接种量增大到１５％时，多糖产量反而降低，分析原冈，当接种量过大时，产酸速度过快，发酵时间短。抑制了产黏菌株的生长以及多糖代谢物的积累。此外，接种量过人，发酵制品的香气也不足，可见，接种量过大也对产香菌株有抑制。所以增大接种量虽然可以缩短发酵时间，但产品的品质却大大降低。综合各方面因素，５％的接种量是比较合适的。中国农业大学硕士学位论文第四章开菲尔粒产开菲尔多糖的发酵条件优化８一ｌａｃｔｏｓｅ■摇床培养固静置培养７６５ｉｌＬＡＢ目ｇｌｕｃｏｓｅ口ｓｕｃｒｏｓｅＬＡＢＹｅａｓｔＡＡＢＹｅａｓｔＡＡＢ菌的种类菌的种类图４－３培养方式对开菲尔中乳酸茁、酵母菌、醋酸菌数目的影响Ｆｉｇ．４—３ＥｆｆｅｃｔｏｆｃｕｌｔｕｒｅｍｅｔｈｏｄｏＢ圈４＿４碳源对开菲尔中乳酸菌、酵母菌、醋酸菌数目的影响ｌａｃｔｉｃａｃｉｄＦｉｇ４—４Ｅｆｆｅｃｔｏｆｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｏｎｌａｃｔｉｃａｃｉｄｂａｃｔｅｒｉｕｍ，ｙｅａｓｔ，ａｃｅｔｉｃａｃｉｄｂａｃｔｅｒｉｕｍｃｏｕｎｔｓｍｉｃｒｏｆｌｏｒａｂａｃｔｅｒｉｕｍ，ｙｅａｓｔ，ａｃｅｔｉｃａｃｉｄｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｌｏｍｃｏｕｎｔｓｏｆｋｃｆｉＬｍｉｃｒｏｏｆｋｃｆｉｒ．４．５．３培养方式对开菲尔多糖产量的影响开菲尔粒颗粒状的形态以及在牛乳中上浮生长的特性限制了发酵过程中开菲尔粒与牛乳的充分接触，导致发酵不均匀，同时也限制了微生物数目的繁殖。摇床培养与静置培养两种方式对微生物数目的影响如图４－３，可见摇床培养方式发酵液中的微生物数目明显高于静置培养，多糖产量分别为１６２２．１８ｍｇ／Ｌ、１５６３．７３ｍｇ／Ｌ，摇床培养略高于静置培养。且在相同的发酵时间内，摇床培养的ｐＨ值为３．７９，静置培养４．０７。但从凝乳状况上，静置培养发酵液还保持着较好的凝胶状态，而摇床培养则完全没有形成凝胶结构，可见摇床培养破坏了发酵乳凝胶结构的形成。４．５．４碳源对开菲尔多糖产量的影响碳源对微生物数目的影响如图４，４所示。实验选用了乳糖、葡萄糖、蔗糖三种常见碳源。三种碳源情况Ｆ，乳酸菌、酵母菌的数目相差不大，醋酸菌出现了对碳源的偏好情况，添加乳糖时，醋酸菌数目最少，添加葡萄糖醋酸菌数目有所增加，添加蔗糖醋酸菌数目晟高。从发酵时间来看，添加一定碳源后，发酵时间均有所缩短，多糖产量也均有明显的增加。添加乳糖时，多糖产量为２２６４．９３ｍｇ／Ｌ，添加葡萄糖多糖产量为２５０４．３５ｍｇ／Ｌ，添加蔗糖多糖产量为２８０６．１６ｍｇ／Ｌ。可见，蔗糖为碳源时最有利于多糖的产生。结合图４－４微生物的生长情况，在乳酸菌、酵母菌生长情况相近的情况ｒ，醋酸菌数目多，多糖的产最高，因此，从微生物共生作用角度来讲，醋酸菌有利于刺激乳酸菌产生多糖。