开菲尔粒发酵条件优化及冷冻干燥工艺的研究(1) - 图文(4)

第二章菌种的分离及发酵特性初探开菲尔粒起源于苏联高加索地区，并且广为食用。随着开菲尔健康营养作用的不断宣传，越来越多的专家学者开始关注开菲尔，并展开研究工作。同时也有很多国家发现过本国的类似开菲尔粒资源，例如，我国现在民间流传的西藏灵菇、雪莲等，这些都被认为是开菲尔粒的一个品系。不同来源的开菲尔粒其微生物组成上会有所差异。目前德国、爱尔兰、葡萄牙、奥地利、两班牙、阿根廷、巴基斯坦、南非、土耳其、韩国、日本等国家均有学者进行过菌种分离鉴定工作。分离出的微生物主要有乳酸菌、酵母菌两大类，醋酸菌也有发现。我Ｉ虱有关开菲尔的研究兴起子近几年，目前的研究１二作主要集中在菌种的分离、鉴定方面，得到的结论与国外研究报道基本一致。本章实验对本实验室收藏的开菲尔粒进行了菌种工作，并对这儿株菌的发酵特性进行了初步研究。２．１材料与仪器２．１．１试验材料１．菌种：开菲尔粒２．乳酸菌分离培养基（ａ）Ｅｌｌｉｋｅｒ琼月目培养基（１Ｌ）：胰胨２０９、蔗糖５９、酵母提取物５９、氯化钠４９、明胶２．５９、乙酸钠１．５９、葡萄糖５９、抗坏向酸Ｏ．５９、乳糖５卧琼脂１５９（ｂ）ＭＲＳ琼脂培养基（１Ｌ）：蛋白胨１０９、肉膏１０９、酵母提取物５９、磷酸氢二钾２９、柠檬酸二铵２９、乙酸钠５９、葡萄糖Ｚ０９、吐温８０ｌｍｌ、七水合硫酸镁０．５８９、四水合硫酸锰０．２５９、琼脂１５９∽乳酸菌分离培养基（１Ｌ）：牛肉膏１０９、蛋白胨１０９、酵母膏１０９葡萄糖１０９、番茄汁２０％、吐温８０Ｏ．０５％、碳酸钙２０９、溴甲酚绿０．０１％、琼脂１５９３．醋酸菌培养基（ＩＬ）葡萄糖１００９、酵母提取物１０９、琼脂１５９４．酵母菌培养基麦芽汁培养基（１Ｌ）：麦芽汁１２．５。Ｂｒｉｘ、琼脂１５９其中乳酸菌、醋酸菌分离培养基中添加２％的真菌抑制剂纳它霉索。５．全脂纯牛奶北京三元食品股份有限公司１２中国农业大学硕士学位论文第二章菌种的分离及发酵特性初探２．１．２试验仪器ＭＬｓ．３０２０全自动杀菌釜：日本三洋电器有限公司ＬＲＨ．２５０生化培养箱：上鹰一恒科技有限公司ｐＨＳ－ｅＳ型ｐＨ计：上海雷磁仪器厂ＤＬ－ＣＪ—ＺＮ高性能无茁实验台：哈尔滨市东联电子科技开发有限公司２．２试验方法２１２，１蓍种分离方法１、开菲尔粒的活化：将冷藏在４℃条件下灭菌乳中的开菲尔粒过滤出来，用无菌生理盐水清洗掉表面的凝乳，用无菌滤纸吸干表面的水分。将开ｔｇｈ＜粒按１：５０（ｍ／ｍ）比例接入灭菌牛乳中，２５。ｃ下培养２０ｈ，活化三代后用作开菲尔发酵乳的发酵剂。２、菌种的分离：将活化好的开非尔粒以５％的接种量接种至灭菌牛乳中，３０。Ｃ培养，发酵１７ｈ后，将开菲尔粒滤出，然后吸取ｌｍｌ发酵液至９ｍｌ无菌生理盐水中，依次稀释成１０．２，１００，１０４，１０一，１０一，最后分别吸取后３个稀释度的菌液至无菌培养皿中．用倾注法将乳酸西培养基倒入平皿，井摇匀；吸取１０一，１０～，１０４三个稀释度的菌液Ｏ．１ｍｌ到酵母菌培养基中，用无菌玻璃刮刀涂布均匀；吸取ｌｏ～，１０～，１０‘６二个稀释度的菌液ｏ．１ｍｌ至醋酸菌培养基中，用无菌玻璃刮刀涂布均匀。每个稀释度重复三次，于３０℃培养．观察生长情况．镜检初筛，３、革兰氏染色：将分离出的乳酸茵涂片固定，先用结晶紫染色一分钟，蒸馏水冲洗；再用碘液媒染一分钟，蒸馏水冲沈々然后酒精脱色三十秒｛最后番红复染一分钟，蒸馏水冲洗，凉干后滴加香柏油显微镜ｒ观察。紫色为阳性，红色为阴性。４、过氧化氢酶试验：配制１０％冻度的过氧化氢溶液，将过氧化氢溶液滴加到分离纯化的菌株上，如有气泡产生，为烈性反应：没有气泡，瞬蛙反应。５、乳酸定性测定：采用纸层析法。溶剂系统为乙醇；浓氨水：水＝８０：５；１５＋显色剂为０．０４％的溴甲酚紫酒精溶液，层析时将乳酸配成ｌ％的标准溶液，点样２ｕｌ，上行层析，显色，与标准样比较删。２．２．２乳酸菌、酵母菌发酵特性ｌ、将４株乳酸菌ＬＥＫｌ，ＬＬ２．ＬＭ２，ＬＭ６在同体斜面培养基上活化２～３次，分别接种到１０ｍｌ灭菌乳中，再两两复配援种到１０ｍｌ灭菌乳中，３０。Ｃ培养，分别测定旋酵２４ｈ，４８ｈ的ｐＨ值。２、将酵母菌接种至１０ｍｌ灭菌乳中３０。Ｃ培养１２ｈ，再接入乳酸菌３０。Ｃ培养２４ｈ，测定最终中国农业大学硕士学位论文第二章菌种舶分离及发酵特性初探ｐＨ值。２。３结果与讨论２．３．１菌种的分离从开菲尔粒中分离出来的微生物见表２－１所示。从革兰氏染色和接触酶实验的情况来看ＬＥＫｌ，ｕ上，ＬＭ２，Ｌ／Ｖ１６属于乳酸菌，Ａ１属于醋酸菌，ＹＰｌ是典型的酵母特征。纸层析法乳酸定性实验中ＬＥＫｌ，ｕ上，Ｌｌｖｌ２，ＬＮｌ６的Ｒｆ值分别为０．８０，０．８１，０．８１，０．８２，乳酸标样的Ｒｆ值为０．８１，可见这四株菌均产乳酸，可以初步认为是乳酸菌。表２－１菌落形态及直径Ｔａｂｌｅ２－１Ｔｈｅｃｈａｒａｃｔｅｒｓａｎｄｄｉａｍｅｔｅｒｓｏｆｉｓｏｌａｔｅｄｓｔｒａｉｎｓ一堕呈一堕整堡查ＬＥＫｌ白色圆形小菌落，边缘光滑，有凸起真堡鲤卿…～兰兰垦鎏鱼一一矍熊堕０．５～１．０Ｇ＋．堡堡垄查长杆…。ＬＬ２白色圆形小菌落，边缘光滑，有凸起０．５Ｇ＋．短杆菌，链状，有荚膜ＬＭ２白色圆形菌落，边缘光滑，有凸起１．０Ｇ＋，中等长度杆菌，呈链ＬＭ６白色圆形菌落，于培养基底部生长１．０～２．０Ｇ＋．短杆菌，呈链Ａｌ黄褐色圆形小菌落，０．５～１．０边缘光滑，菌落扁平Ｇ＋＋链状短杆菌ＹＰｌ乳白色圆形菌落，凸起生＆，边缘光滑２．０～３．０～一椭圆形酵母，芽殖２．３．２乳酸菌、酵母菌发酵特性将从开菲尔粒中分离山的乳酸菌、酵母菌再接回牛乳中发酵，检测其发酵特性．结果如表２－２所示。乳酸菌与酵母菌的混合发酵如表２—３所示。表２－２乳酸菌产酸试验Ｔａｂｌｅ２－２ＬａｃｔｉｃａｃｉｄｂａｃｔｅｒｉａｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｃｈａｒａｃｔｅｒｏＨＬＥＫｌＬＩ。２６．８６６．８３６．８０ＬＭ２６．８６６．８３６．８１ＬＭ６６．８６６．８４６．８０ＬＥＫｌ／ＬＬ２６．８６６．８３６．８１ＬＥＫｌ／ＬＭ２６．８６６．８３６．８０ＬＥＫＩ／ＬＭ６６．８６６．８０６．７９ＬＬ２／ＬＭ２６．８６６．８０６７７ＬＬ２／Ｌｍ６６．８６６．８２６．７９ＬＭ２／ＬＭ６６．８６６．８０６．８０初始６．８６２４ｈ４８ｈ６．８２６．７８１４中国农业大学硕士学位论文表２＿３乳酸菌与酵母菌混合发酵Ｔａｂｌｅ２－３第二章菌种的分离－；｝乏发酵特性初探Ｍｉｘｅｄｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｏｆｌａｃｔｉｃａｃｉｄｂａｃｔｅｎａａｎｄｙｅａｓｔ由上述两个表格的数据可以看出，从开菲尔粒中分离出的乳酸菌单独及混合发酵的能力都变得很差，儿乎不能产酸，而当乳酸菌与酵母菌混合培养时，可以产酸发酵，但发酵速度远远低于开菲尔粒的发酵速度。由此可见，开非尔粒中乳酸菌与酵母菌之间存在着强烈的共生关系，分离后，单株菌的发酵能力都变差。２．４本章小结从开菲尔粒中分离出４株乳酸菌，１株醋酸菌，１株酵母菌。其中，ＬＬ２号显微镜下观察有荚膜存在。对乳酸菌、酵母菌的产酸性能进行了初步研究，发现分离出的乳酸菌单独或者混合接种于牛乳中时，几乎不能发酵，但将乳酸菌与酵母菌混合培养，发酵可以进行，但发酵速度依然很慢。可见开菲尔粒中乳酸菌与酵母菌存在着强烈的共生关系，同时也表明，用从开菲尔粒中分离出的菌株复配发酵生产的开菲尔的可行性并不好。中国农业大学硕士学位论文第三章开菲尔多糖分离、提取条件的选择第三章开菲尔多糖分离、提取条件的选择３．１概述开菲尔是起源于高加索地区的一种传统酒精性发酵乳饮料，迄今已有上千年的食用历史，被认为是高加索地区人们健康长寿的重要原冈之一，已经引起各国专家、学者的广泛关注。开菲尔的发酵剂一一开菲尔粒（ｋｅｆｉｔｇｒａｉｎ）是一种类似花椰菜样的粒状结构体，直径１－１５ｍｍ，白色或浅黄色，由乳酸菌和酵母菌共生而成。开菲尔的各种微生物代谢产物中最受关注的是乳酸菌代谢产生的胞外多糖，被命名为开菲尔多糖（ｋｅｆｌｒａｎ）。微生物胞外多糖普遍有抗肿瘤活性，１９８２年，日本学者Ｓｈｉｏｍｉ通过小鼠口服实验验证了开菲尔多糖的抗肿瘤活性，其对肿瘤细胞的抑制效果为４０－６０％，有时高达８０％。开菲尔多糖是目前为止唯一通过动物口服实验验证其抗肿瘤活性的微生物胞外多糖。１９６７年，ＰＫｏｏｉｍａｎ发现开菲尔多糖由葡萄糖和半乳糖以１：１的比例组成，并以Ａ个单糖为重复单元形成的分子量在１００万以上的人分子物质。其分子结构示意图如３—１所示。开菲尔多糖网其大分子的特性，还可以Ｈｊ来做增稠剂、稳定剂、乳化剂、脂肪替代品等，从而改善产品的品质。因此提高开非尔多糖的产照已经成为各国科研工作者的研究热点。为了便于胞外多糖的分离提取，国内外有很多工作者多选用ＭＲＳ培养基等人工培养基体系培养乳酸菌。事实上，牛乳才是乳酸菌生长的最佳培养基，然而牛乳中的酪蛋白、乳清蛋内等大分子物质，分子量与胞外多糖接近，且组成成分要比人Ｊ二培养基复杂的多，所以造成牛乳体系中，微生物胞外多糖的分离较困难。此外，微生物分泌的多糖进一步可细分为荧膜多糖，指包在菌体表面形成荚膜的那部分多糖，胞外多糖是指分泌到培养基中的那部分多糖。因此，本章针对这一问题，对发酵乳体系中开菲尔多糖、荚膜开菲尔多糖的分离提取方法进行了研究，以期为开菲尔的进一步研究提供必要的基础。囤３－１开菲尔多糖分子结构Ｆｉｇ．３－１ｍｏｌｅｃｕｌａｒｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｋｅｆｉｒａｎ１６