开菲尔粒发酵条件优化及冷冻干燥工艺的研究(1) - 图文(7)

中国农业大学硕士学位论文第四章开菲尔粒产开菲尔多糖的发酵条件优化目２０℃●２５℃口３０℃罟Ｈ魁琏霜墟ＬＡＢＹｅａｓｔＡＡＢ菌的种类图４－５培养温度对开菲尔中乳酸菌、酵母菌、醋酸菌微生物数目的影响Ｆｉｇ．４—５Ｅｆｆｅｃｔｏｆｃｕｌｔｕｒｅｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ０１１ｌａｃｔｉｃａｃｉｄｂａｃｆｅｆｉｕｍ，ｙｅａｓｇａｃｅｔｉｃａｃｉｄｂａｃｔｅｒｉｕｍｍｉｃｒｏｆｌｏｒａｃｏｕｎｔｓｏｆｋｅｆｉｒ培养温度对微生物数目的影响如图４．５所示。可以看出，温度越高，发酵液中的微生物数目有减少趋势，但是三种温度下三类微生物的比例基本没有变化。而温度越低，发酵时间也越长，２０℃时发酵时间长达５２ｈ。从多糖产量上来看，２０。Ｃ时，多糖产量为１８０８．８５ｒｎｇ／Ｌ；２５＂Ｃ时，多糖产量为１７７２，３２ｍｇ／Ｌ，３０‘Ｃ时，多糖产量为１５３４．８８ｍｇ／Ｌ，即随着温度的升高多糖产量逐渐较少，可见，多糖是乳酸菌在较低温度下逐渐代谢积累的一个产物。然而从生产角度来讲，较长的发酵时间是低效率的，困此，在以后的研究中，均采用３０℃发酵。表４－１不同因素对发酵时间、ｐＨ值、总酸、开菲尔多糖浓度的影响——…——～塑堑堕囹！！！Ｐ坚！～Ｐ生：鱼堕～墅垩玺童煎Ｑ趔清洗清洗１７１７４．０９４４．０８４．０５１１９．５１２８．０１５６３．７３１８１９．４４Ｔａｂｌｅ４—１Ｅｆｆｅｃｔｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｆａｃｔｏｒｓｏｎｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｔｉｍｅ，ｐＨｖａｌｕｅ，ｔｉｔｒａｔｅａｃｉｄ，ｋｅｆｉｒａｎｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ．未清洗４．６本章小结在符合生产实际需求的情况下，对用开菲尔粒接种发酵产开菲尔多糖的条件进行了优化，其产多糖的优化条件为：用清洗后的开菲尔粒按种发酵，接种量５％，３０。Ｃ静置培养，添加１％中国农业大学硕士学位论文第四章开菲尔粒产开菲尔多糖的发酵条件优化蔗糖，发酵１２小时，可以使开菲尔多糖产量最高达到２８０６．ｔ６ｍｇ／Ｌ。中国农业大学硕士学位论文第五章开菲尔粒冷冻干燥条件的研究第五章开菲尔粒冷冻干燥条件的研究５。１概述直投式发酵剂（ＤｉｒｅｃｔｅｄＶａｔＳｅｔ，ＤＶＳ）是指一系列高度浓缩和标准化的冷冻或冷冻干燥发酵剂菌种，可直接加入到熟处理的原料乳中进行发酵，而无需对其进行活化、扩培等其他预处理上作。亩投式菌种使用方法快捷经济，可有效防止菌种在保存和扩培过程中菌种组成及活性发生改变。真空冷冻干燥技术制各高效浓缩型发酵荆，早在７０年代末至８０年代初就引起西方发达国家的高度重视井进行研究和试制，丹麦Ｈａｎｓｅｎ公司的乳晶发酵剂的研究水平处于国际领先地位，并于１９８８年生产山超浓缩且真按使用的酸乳发酵剂，其菌数达１０“ｍｌ～。而国内近期才开始研究。用真空冷冻干燥技术制备高效浓缩型发酵剂的基本工艺流程是首先将目标菌株高密度培养，在菌种活力、浓度最高时收集菌体，将收集到的菌体重新悬浮在合适的冷冻保护剂中，颓冷，真空冷冻干燥。影响微生物冻于效果的因素有很多，如菌株、细胞大小及形状、生长阶段及速率、初始细胞浓度、ｐＨ值、保护剂系统、预球温度、降温速率、冷冻干燥条件、细胞含水量、细胞膜成分和复水条件等。其中保护剂系统的影响最为突出。著在冻干时采取一定的保护措施、加入适宜的保护剂系统，可在很大程度上减轻或避免冷冻干燥对细胞带来的损伤。影响微生物在真空冷冻干燥过程中细胞存活率和发酵活力变化的主要因素有：培养基、培养条件、收获期、保护荆及ｐＨ值、冷冻速度、干燥过程、残留水分、复水条件等，其中保护剂是最为复杂，研究最多，最难选择的关键因索。然而，开菲尔粒的特殊形式决定了开非尔粒的冷冻干燥工艺不能完全照搬莆通乳酸菌冷冻干燥上艺。开菲尔粒上微生物种类较多。而各种微生物对低温的抵抗力又各不相同；而且开菲尔粒上微生物数目已经固定，无法再富集培养。因此，开菲尔粒的冻干前处理，以及冻干保护剂的选择就显得更加重要。本章内容对开菲尔粒的冷冻前处理、冻干保护剂的选择两部分内容进行了研究。５．２材料与仪器５．２．１实验材料１、菌种：开菲尔粒（本实验室收藏）２、培养基：灭菌全脂牛奶，灭菌条件：１１５。Ｃ，１５ｍｉｎ。３、基础保护剂：脱脂乳还原奶，浓度：１０％，灭菌条什：１１５＂（２，１５ｍｉｎ。４、葡萄糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、山梨醇、甘油、木糖醇５．２．２仪器ＭＬＳ－３０２０全自动杀菌釜：日本三洋电器有限公司ＬＲＨ．２５０生化培养箱：上海一恒科技有限公司ｐＨＳ－２５型ｐＨ计：上海雷磁仪器厂ＤＬ－ＣＪ．ＺＮ高性能无菌实验台：哈尔滨市东联电子科技开发有限公司ＬＧＪ．１８型冷冻干燥机：北京四环科学仪器厂ＮＤＴ－７９型旋转式粘度计：同济大学机电厂５．２．３发酵能力检测方法检测指标：凝乳时间、ｐＨ值、乳酸菌、酵母菌活菌数、黏度ｐＨ值测定：用ｐＨＳ－２５型ｐＨ计直接测定乳酸菌计数：用ＭＲＳ培养基倾注法计数酵母菌计数：用麦芽汁培养基倾注法计数黏度：粘度计法５．３实验方法５．３．１开菲尔粒破碎粒径的选择１、将活化好的开菲尔粒用无菌剪刀破碎成粒径为２—３ｍｍ、５－１０ｍｍ两个级别的小粒，再挑选粒径在１５～２０ｍｍ、夫于２０ｍｍ以上两个级别的整粒开菲尔粒，每个粒径级别的开菲尔粒均称重５．００９。２、向处理好的开菲尔粒样品中添加１５ｍｌ１０％灭菌脱脂乳，每个粒径级别均有添加脱脂乳保护荆和不添加的对照。用。８０℃的超低温冰箱中预冻３小时，用真空冷冻干燥机冷冻干燥。另取破碎粒径为５～１０ｒａｍ，整粒粒径１５～２０ｍｍ的开菲尔粒直接放入．８０。Ｃ的超低温冰箱中预冻，冷冻干燥机干燥，冻干条件：．５５℃，１３Ｐａ真空度，冻干时间４８ｈ。３、将冻干样品用研钵碾成均匀的粉末，分别称取１．ＯＯｇ按种至１００ｍｌ灭菌乳中，３０＂Ｃ培养２０．５ｈ。４、对照：新鲜开菲尔粒接种，５％的接种革，３０。Ｃ培养２０．５ｈ。５．３．２开菲尔粒与脱脂乳比例的确定１、将活化好的开菲尔粒用无菌生理盐水清洗干净，用无菌滤纸吸于表面的水分。称５．００克鲜粒七份，每份样品中分别加入１０％的灭菌脱脂乳０ｒａｌ，５ｍｌ，１０ｍｌ，１５ｍｌ，２０ｍｌ，２５Ｉｌｌｌ，第七份为鲜粒接种对照。并将各样品放入一８０℃的超低温冰箱中预冻３小时，中国农业大学硕士学位论文第五章开菲尔粒冷冻干燥条件的研究立即用真空冷冻干燥机冻干，冻干条件：．５５℃，１３Ｐａ真空度，冻干时间４８ｈ。每个样品做两个平行。２、将冻干样品用研钵碾成均匀的粉末，按相同的接种量接种到灭菌乳中，３０℃培养１８．５ｈ；５．３．３脱脂乳浸没程度对冻干效果的影响１、将活化好的开非尔粒用无菌生理赫水清洗干净，用无菌滤纸吸干表面的水分。称取５．００９鲜粒五份，每一份中添加１，５０９脱脂乳粉，再分别加入无菌水２５Ｊ１ｌｌ，２０ｍｌ，１５ｍｌ，１０ｒｎｌ，０ｍｌ，鲜粒接种作为对照。每个样品做两个平行。２、将处理好的样品放在，８０℃冰箱中预冻３ｈ，立即用冷冻干燥机干燥，冻干条件：一５５℃，１３Ｐａ真空度，冻干时间：４８ｈ。３、将冻干样品在无菌条件下用研钵碾成均匀的粉末，称１．００９接种至灭菌乳中，３０℃发酵１９ｈ。５３．４糖醇类化合物对冻干效果的增效作用１、将活化好的开菲尔粒用无菌生理盐水清洗干净，并用无菌滤纸吸千表面的水分。２、配制１０％的脱脂乳复原乳，并分别添加５％的糖醇类物质：葡萄糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、聚乙二醇、、山梨醇、甘露醇、甘油。３、称５．００９开菲尔粒菌种，加入１５ｍｌ配制好的保护剂溶液。每个样品做两个平行，弗将各样品放入．８０℃的超低温冰箱中预冻３ｈ，立即用真空冷冻干燥机冻干，冻干条件：４５℃，１３Ｐａ真空度，冻干时间４８ｈ。４、将冻干样品在无菌条件下用研钵碾成均匀的粉末，称１．００９接种至灭菌乳中，３０℃发酵】８ｈ。５３．５糖醇浓度实验１、将活化好的开菲尔粒崩无菌生理盐水清洗干净，用无菌滤纸吸干表面的水分。２、配制１０％的脱脂乳复原液，葡萄糖、蔗糖、海藻糖、山梨醇分别取５％，７％，９％低、中、高三个浓度添加到脱脂乳复原液中，构成冷冻保护剂。３、称５．００９开菲尔粒，加１５ｍ１冷冻保护剂，每个样品做两个平行，并将各样品放入．８０℃的超低温冰箱中预冻３ｈ，立即用真空冷冻干燥机冻干，冻干条件：．５５℃，１３Ｐａ真空度，冻干时间４８ｈ。４、将冻干样品在无菌条件Ｆ用研钵碾成均匀的粉末，称１．００９接种至灭菌乳中，３０℃发酵１８ｈ。３１