开菲尔粒发酵条件优化及冷冻干燥工艺的研究(1) - 图文(3)

孛国农业大学硕士学位沦文第一室鳍论采卜２开菲尔中的化学成分Ｔａｂｌｅ１－２Ｔｈｅｃｈｅｍｉｃａｌｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｏｌｋｅｆｉｒ成分ｌＯＯｇ成分１００９能量脂肪％蛋自质％矿物质ｇ钙０１２Ｏ．１０１２０１５０，０５０．１０磷镁钾钠氯乳糖％水分％乳酸ｇ酒精ｇ胆固醇ｍｇ磷酸盐ｍｇ必须氨基酸Ｅ色氨酸苯丙氨酸＋酪氨酸亮氨酸异亮氨酸苏氯酸蛋氨酸＋臆氮酸赖氨酸缬氨酸维生素ｍｇＡ０．０６姚”弘枷ｌ曼瞄∽ｎ蚰微量元素ｇ铁ｍｇ铜ｔｉｇ钼ｕｇ锰”ｇ０．０５１２５．５５０．３６锌ｍｇ风眯物质乙醛ｌ呈哺㈣蚴啪㈣啷咙ｊ‘二酮乙偶姻Ｂ，２Ｄ．５胡萝Ｆ泰０．０２Ｂ１Ｂ２Ｂ３０．０４０．１７０．０５定免酸８．０９ＣＤＥｌ００８Ｏ．１１１．２．４功能及作用机理（１）提高免疫功能，强化免疫系统，增强免疫细胞活力，具有谲ｊｒ机体的特异性和非特异性免疫功能㈤ｍ１。（２）调节循环和呼吸系统功能，开菲尔增强一ｔ；＇ｌｌｆｆ【｜：ｋ－Ｎ３］，呼吸加深及调整血压，净化血液，调节血脂；（３）开菲尔增强有益菌群的优势，刺激肠道，加强胃肠流动，加速唾液，胰酶的分泌，增强胃肠和胰藏的功能，增强消化系统功能ｉ３”；（４）具有荫癌坑癌作用。开菲尔对免疫系统有强化作用．对体液免疫，细胞免疫有调节作用，并能增强巨噬细胞能力和自然杀伤细胞的话力，能清除异常突变细胞，起到防癌和抗癌的功效［３８１一［４啪。（５）具有抗菌消炎的功能。开菲尔中的乳酸、乙酸、胞外多糖等物质可以抑制肠内病原性微生７中国农业大学硕上学位论文第一章绪论物的生长，对结核杆菌，大肠杆菌，志贺氏菌等病原菌具有强烈的抑制作用［４１１。（６）具有抗疲劳功能，开菲尔提高ＡＴＰ活性促进机体代谢，有效的清除体内代谢废物，恢复体力，使精力旺盛。（７）具有恢复肝脏功能。开菲尔具有对人体免疫系统的强化和刺激作用，可阻止病毒吸附和穿入易感的止常细胞，并增强吞噬细胞杀毒能力而回复肝脏的功能Ｈ“。开菲尔是用牛奶发酵的食品，所咀不但具有牛奶所含有的营养元素，而且由于多种有益微生物菌相作用使产品的营养比原乳有了很大提高，易于消化，具有丰富的营养。总之，开菲尔是可以全面调理人们机体功能，有病治病，无病防病的全功能的保健佳品。１．２．５乳酸菌胞外多糖的研究乳酸苗胞外多糖（ＥｘｏｐｏｌｙＳａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，ＥＰＳ）是乳酸菌在生长代ｌ酎过程中分泌到细胞壁外常渗丁培养基的一类糖类化合物，有的依附于微生物细胞壁形成荚膜，称为荚膜多糖；有的进入培养基形成粘液，称为粘液多糖，它们都是微生物适应环境的产物。近儿十年来，由于微生物胞外多糖在产品结构、性能及生产方面所具有的特别优势而得到大力研究和开发，新的微生物胞外多糖的开发已成为工业微生物研究的热点之一。由于乳酸菌是食品级工业生产菌，与其他菌相比安全性高，所以近年来对乳酸菌胞外多糖的研究逐渐增多。但产量低，菌株稳定性差，仍是制约其大规模生产的主导因素。现在各国科学家试图用基因Ｔ程的手段构建高产菌株，但至今仍没成功。乳酸菌胞外多糖可赋予发酵乳制鼎特殊的质构和风味，起到安全的食品添加荆的作片ｊ””，它还有可能成为食品级多糖的一个良好来源而广泛用于各种食品的增稠、稳定、乳化、腔凝及持水““。胞外多糖还具有生物活性如免疫活性、抗肿瘤和抗溃疡，可应用于医药领域。目前，一些常见乳酸菌产胞外多糖的能力：＆ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ５０。３５０ｍｇ／Ｌ；Ｌｂ．Ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉｓｕｂｓｐ．Ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ６０～１５０ｍｇ／Ｌ；Ｌ．１ａｃｔｉｓｓｕｂｓｐ．Ｃｒｅｍｏｒｉｓ２５－６００ｍｇ／Ｌ；肋．Ｃａｓｅｉ５０—６０ｍｇ／Ｌｔ４”。这样的产最与其它产多糖的细菌相比是十分有限的，比如Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ产黄原胶，其产量为１０～２５叽是目前主要的商业多糖ｉ４ｑ。一些乳酸菌的产多糖能力不稳定，这与嗜温乳酸菌的质粒丢失有关１４７］，而嗜热菌株的合成机制还不清楚。由此可见，乳酸菌胞外多糖距离商业化还有很长的一段距离。影响乳酸菌产胞外多糖的因素除菌株（种）外，还包括培养条件、培养基组成、金属离子和化学试剂等冈素。培养条件主要有：培养温度、ｐＨ值、发酵时间等；培养基组成主要是碳源、氮源等因素；金属离子和化学试剂可以影响合成胞外多糖的酶类物质，从而影响胞外多糖的产量【”Ｊ【４”。目前，关于ｋｅｆｉｒａｎ产量的研究并不多，最早是日本学者ＨａｍｈｉｋｏＹｏｋｏｉ等人研究了菌株Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．ＫＰＢ一１６７Ｂ产ｋｅｆｉｒａｎ的优化培养基，发现在ＭＲＳ改良培养基上，菌株产多糖量最高达２．０４９／［，，培养条件为ｐＨ值为５．０，温度３０℃，发酵时间４天”０１。２００１年，Ｂ．Ｃｈｅｉｒｓｉｌｐ等人以ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｋｅＪｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ为研究菌株，建立了培养条件、培养基、产多糖量等因素的数学模型”“。２００３年，ＢｅｎｊａｍａｓＣｈｅｉｒｓｉｌｐ等人通过混合培养的方式增加了Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌ］ｕｓｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ产多糖的量，即将乳杆菌和酵母菌混合培养，酵母可以利削乳酸，降低乳酸浓度，从而刺激细胞的生长和乳杆菌产多糖的嚣”。。国内到目前为止还未检索到研究开菲尔多糖的文献。开菲尔粒中产多糖的菌为嗜温菌株，其产多糖的性质由质粒控制，质粒容易丢失，８中国农业大学硕上学位论文第一章绪论从而丧失产多糖的特性，同时产多糖的能力也是有限的。因此，单独研究开菲尔粒中产多糖的乳酸菌，即不能保证特征的稳定性，也不能保证产量。１．２．６菌种的冷冻干燥随着发酵技术的发展，发酵剂的制备方法也得到了发展与提高，目前根据发酵乳制品方面的应用情况，可将发酵剂分为三种类型，即天然发酵剂、普通发酵剂和浓缩发酵剂天然发酵剂一种利用原料乳自然发酵而制成的液体发酵产物。其特点是菌种成分复杂，除乳酸菌外，还有酵母菌等微生物，发酵产物成分较多。普通发酵剂首先由Ｌｉｓｔｅｒ从酸奶中分离出乳酸链球闰，并对其进行研究，将分离提纯的乳酸菌作为发酵剂来生产发酵乳制品，引起了人们的兴趣。美国、丹麦和德国也曾对此普通发酵剂进行研究，并发表了这方面的文章。普通乳酸菌发酵剂的特点是菌种纯正、发酵性能稳定，发酵产物除了乳酸外，还有一定的风味物质、维生素、抗菌物质等。冷冻浓缩发酵剂在二十世纪初开始研究，目的在丁Ｉ提高发酵剂的活菌数，制备出一次性接种制各生产发酵剂或发酵乳制品的发酵剂，减少制备普通乳酸菌发酵剂的繁重Ｊ：序和传代复壮次数，防止菌株变异及噬菌体的污染。该发酵剂的活菌数可达１０９～１０“个／ｇ．但由于冷冻浓缩发酵剂在贮藏和运输中比较麻烦，影响其推广应用。目前，我国发酵奶得生产过程中，所用的乳酸菌大多为国外购进的直投式酸奶发酵剂（Ｄｉｒｅｃｔ．ｔｏ．ｖａｔｃｕｌｔｕｒｅｓ，简称ＤＶＳ），继代式酸奶菌种的应用量很小。继代式菌种需要经过活化、扩增才能用于乳品生产。这种发酵剂用量大，制作过程繁杂，质量不容易控制，容易污染杂菌和噬菌体，菌种比例随着传代数的增加而改变，导致产品质量不稳定和口感著。直投式发酵剂不需要经过活化、扩增，直接应用于生产，并且活菌含量高（１０“’～１０“／ｇ），保质期长，接种量少，使得每批发酵产品质最稳定，也防止了菌种的退化和污染，大大提高了发酵奶制品工业的劳动生产率和产品质量。开菲尔粒中微生物种类多，且彼此之间有强烈的共生关系。乳酸菌、酵母菌、醋酸菌按照一定的规律有序的排列在开菲尔粒上，开菲尔粒主要由多糖、蛋白质等成分组成，有一定的韧性和弹性，不溶于水，很难确定开菲尔粒中微生物的种类和数量，同时，受目前微生物分离技术的限制，开菲尔粒中很有可能有一些数目很少但作用关键的微生物不能被分离出来。因此，把从开菲尔粒中分离出来的微生物制成纯菌种发酵剂在复配组合发酵的方法得到的开菲尔是以牺牲开菲尔粒中部分有益微生物为代价的，其微生物组成及营养价值方面均不如传统发酵得到的开菲尔．只能称为类开菲尔产晶。活力良好的开菲尔粒具有繁殖能力，形状不规则，且浮在牛乳上层生长，这就限制了用开菲尔粒做生产发酵剂的大规模工业化生产。因此借鉴直投式菌种的方法，如果将开菲尔粒整体冷冻干燥，使得开菲尔粒中的微生物按照原始的组成配比存活下来，再将冻干后的样品制成菌粉，那么用冻干菌粉发酵就可以得到和传统开菲尔制品一致的产‘品。制备传统的冷冻干燥发酵剂时，需先将纯化好的菌种接种到适台的培养基中富集培养，然后收集菌种，使其悬浮于含有保护剂的溶液（分散剂）中，预冻，最后进行冷冻干燥。开菲尔粒的冷冻干燥有别于普通的微生物冷冻干燥。只要开菲尔粒活力良好，开菲尔粒上微生物的组９中国农业人学硕上学位论文第一章绪论成数目就已经固定，无法进一步富集培养，同时，开菲尔粒中的微生物分布在颗粒表面和内部，冷冻保护剂只能保护表面的微生物，内部的微生物无法接触到。开菲尔粒又是一个有形不规Ⅲ０的颗粒状形态，如何添加保护剂，添加多少也不同丁普通微生物冷冻干燥的做法。在冷冻干燥发酵剂的制作过程中，冷冻干燥环节对微生物的危害很大：①细胞内冰晶的形成，冰晶有机械刺伤作用和溶质效果；②细胞膜成分的丧失及膜的渗漏和穿孔；⑧关键蛋白的变性；④生物细胞膜叠状六棱形的形成；⑤新陈代谢过程中各类关键作用酶的活性改变。“…通过添加冷冻保护剂可以保护菌体不受上述作用的破坏。目前关于保护剂的保护机理的几种假说主要建立在保护剂与细胞膜宏观结构的作用基础上：①增强磷脂膜的稳定性：多羟基的糖类保护剂以氢键或其它方式与细胞壁上磷脂膜结合，增大头部空间，降低了磷脂的转变温度，也使磷脂膜之间不致产生折叠粘连而至细胞死亡…“”１；②玻璃体学说：渗透性保护剂的加入可限制冰晶的形成而形成玻璃体，减少了冰晶的机械破坏作用“…；③包埋作＿｝；｝ｊ：某些具包埋特性的材料，可将菌体包埋掩蔽而减少细胞内冰晶的形成，但可能影响菌体活性的发挥。保护剂的保护机理是一个涉及范围十分广阔的领域，保护剂与细胞宏观结构的的作用并不能解释不同种类、不同用量及复配保护剂等一系列因素的不同保护作用。同种保护剂对不同微生物的保护效果也不同。目前，国内外报道过的乳酸菌冷冻保护剂主要有以Ｆ几大类：多元醇：甘油、侧金盏花醇、甘露醇糖类：蔗糖、乳糖、麦芽糖、葡萄糖、海藻糖、糊精蚩白类及肽类：脱脂乳、血清蛋白、蛋白胨氨基酸类及其它：谷氨酸钠、胱氨酸、天冬氨酸、Ｂ一磷酸甘油、Ｌ一赖氨酸。１．３立题依据近十多年来，在世界范围内掀起了一股研究和生产功能性食品的热潮，功能性食晶和饮料极受欢迎。很多专家和学者认为它将成为２１世纪的主导食晶。功能性食品（包括功能性饮料）在我国也有了Ｅ速的发展，越来越受到人们的重视和喜爱。随着经济的进一步发展和人民生活水平的日益提高，功能性饮料在今后还会有更广阔的发展空间和更美好的发展前景【５”。开菲尔是有着悠久历史的一种民间传统发酵乳饮料，具有多种保健功能，是发酵乳制品的～‘个发展方向。但由于开菲尔是多菌种发酵，其中的乳酸菌、酵母菌、醋酸菌等微生物均有良好的功能性作用，比如乳酸菌中的产粘菌株，其产生的胞外多糖开菲尔多糖有良好的抗肿瘤、抑菌、降血压、降血脂等功能性作Ｈｊ，其中的酵母菌也有一定的抑菌能力。开菲尔多糖是开菲尔中研究虽多的功能性成分之一。是目前为止唯一经过小鼠口服实验验证抗肿瘤作用的微生物胞外多糖，进来又被证明有良好的抑菌、降血压、降血脂等功能，同时，乳酸菌多糖被认为是天然安全的增稠剂、稳定剂，可以改善产品的质构。因此ＨａｍｈｉｋｏＹｏｋｏｉ．（１９９２），Ｂ．Ｃｈｅｉｒｓｉｌｐ．（２００１），ＢｅｎｊａｍａｓＣｈｅｉｒｓｉｌｐ（２００３）等人先后研究了开菲尔粒中产粘菌株产胞外多糖的优化条件。由于开菲尔粒中的产粘菌株属‘ｒ嗜温型乳杆菌，其产多糖的机制受细胞内质粒的控制，而质粒很容易丢失，使菌株丧失产多糖的能力，且单株乳酸菌产多糖的能１０中国农业大学硕士学位论文第一章绪论力仍然是有限的。而产粘菌株和开菲尔粒中的微生物共生在一起时，其产粘性质会很稳定，并且由于共生菌系的协同作用，胞外多糖产量相对要高。冈此，优化开菲尔粒产胞外多糖的条件更具有实际意义。开菲尔流传至今已有上千年的食用历史，其独特的风味和良好的保健功能作用正不断引起越来越多的专家和学者的关注。然而开菲尔的传播并不顺利，主要是它的上业化生产不易实现。目前已经应用的工业化生产方式主要有两种。一是用原始的开菲尔粒做发酵剂，州这种方法可以得到传统、典型风味的开菲尔，且保留了开菲尔粒中的原有菌相，无论在风味还姓在营养价值上均为最佳。然而这种生产方式有很大的弊端，即只能小规模的生产，否则容易出现发酵不均匀的现象；另一种方法是将从开菲尔粒中分离出来的乳酸菌、酵母菌制成纯菌种发酵剂，再重新组合接种发酵。这种方式可以进行大规模的工业化生产，但因为开菲尔粒中的微生物组成十分复杂，人工难以模拟其原始的微生物组成及配比，因此用这种方法生产出来的开菲尔无论在风味上还是在营养价值上都逊色于传统发酵的开菲尔，只能称之为类开菲尔产品。所以，传统的开菲尔制品依然是我们最期望能够大规模商业化生产的。借鉴纯种发酵剂冷冻干燥的方式也许可以实现这一目标。即将开菲尔粒整体冷冻干燥后，制成菌粉。如果开菲尔粒中的微生物可以全部存活下来，那么用冻干菌粉发酵的产品则可以最大限度的接近传统开菲尔。本课题主要研究了开菲尔粒中微生物组成、功能因子开菲尔多糖的检测方法以及开菲尔粒产开菲尔多糖优化方条件，并对开菲尔粒的冷冻干燥条件进行了初步研究。为开菲尔的进一步研究开发和工业化生产提供了理论和实践基础。１．４课题的研究内容本课题的研究内容包括以下几个主要方面１、对开非尔粒混合菌种中的微生物进行分离及形态学观察，并对分离出的微生物的发酵特性进行了初步研究。２、建立了发酵乳体系中乳酸菌胞外多糖开菲尔多糖的检测方法．并优化了开菲尔粒产多糖的条件。３、研究了开菲尔粒冷冻干燥的预处理条件，以及冷冻保护剂组成１１