各位同学：
本学期的植物基因工程实验定于第十一周的周一至周六（10.31-11.5日）在综合楼513室进行。望各位同学提前打印好实验讲义，并在每次实验之前对相应实验内容做好充分预习。 （实验讲义内容及日程安排见网络教学平台。 用户名2009chenshihua 密码：123
具体实验试验内容如下：
大实验一 目的基因的克隆（共计8学时）
实验一 Trizol试剂快速提取植物总RNA （4学时） 实验二 反转录PCR （4学时） 实验三 目的基因的PCR扩增（中间穿插准备下次实验相关材料）（4学时） 大实验二 表达载体的构建（共计24学时）
实验一 琼脂糖凝胶电泳检测、PCR扩增基因产物的回收及重组载
体的构建 （4学时） 实验二 大肠杆菌感受态的制备（CaCl2法） （4学时） 实验三 质粒（重组载体）转化大肠杆菌感受态细胞及转化子的筛选（4学时） 实验四 质粒（碱法）提取及电泳检测 （4学时） 实验五 重组载体（质粒）的酶切和电泳检测 （4学时） 大实验三 目的基因的遗传转化及分子筛选/检测（共计16学时）
实验一 植物转基因操作：渗透法转化拟南芥及转化子筛选
（4学时） 实验二 植物基因组DNA的提取及电泳检测 （4学时）
实验三 转基因植物的PCR检测（及转基因动植物相关检测方法
介绍） （4学时） 实验四 β-葡萄糖醛酸苷酶（GUS）组织化学染色检测转基因植物
（4学时）
基因工程综合实验具体日程安排：
周一上午： 总RNA（Trizol试剂）快速提取 周一下午： RNA电泳检测及反转录PCR
周二上午：周二下午：体的构建
周三上午：周三下午：筛选
周四上午：周四下午：介绍）
周五上午：周五下午：周六上午：周六下午：物
目的基因的PCR扩增（中间穿插准备后面实验用的LB培养基） 琼脂糖凝胶电泳检测并回收PCR扩增基因产物及重组载大肠杆菌感受态的制备（CaCl2法）
质粒（重组载体）转化大肠杆菌感受态细胞及转化子的植物基因组DNA的提取及电泳检测
转基因植物的PCR检测（及转基因动植物相关检测方法质粒（碱法）提取及电泳检测
重组载体（质粒）的酶切及电泳检测
植物转基因操作技术：渗透法转化拟南芥及转化子筛选 β-葡萄糖醛酸苷酶（GUS）组织化学染色检测转基因植
目录
实验一 Trizol试剂快速提取植物总RNA
实验二 反转录PCR（RT-PCR）
实验三 琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物（DNA）
实验四 从琼脂糖凝胶中回收（PCR 产物）DNA片段
实验五 DNA片段的连接（向质粒载体中插入外源DNA）
实验六 大肠杆菌感受态的制备（CaCl2法）及活性检测
实验七 质粒转化
实验八、九 质粒（碱法）提取及重组质粒（重组子）的筛选和酶切检测
实验十 渗透法转化拟南芥及转化子筛选
实验十一 植物基因组DNA的提取及转基因植物PCR检测
实验十二 转基因植物的PCR检测
实验一 Trizol试剂快速提取植物总RNA
实验目的
学习用试剂盒从植物组织中提取总RNA的方法。 实验原理
RNA是一类极易降解的分子，要获得完整的RNA必须在提取过程中最大限度地抑制内源性及外源性核糖核酸酶对RNA的降解作用。高强度变性剂异硫氰酸胍，可溶解蛋白质，破坏细胞结构，使核蛋白与核酸分离，失活RNA酶，所以RNA从细胞中释放出来时不被降解。细胞裂解后，除了RNA，还有DNA，蛋白质和细胞碎片，通过酚、氯仿等有机溶剂处理得到纯化、均一的总RNA，LiCl可以选择性的沉淀RNA，使RNA进一步得到纯化。
TRIZOL试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层（无色）主要为RNA，有机层（黄色）主要为DNA和蛋白质。
焦碳酸二乙酯（DEPC）：一种高活性的烷化剂，通过组胺基团的乙氧基甲酸化形式破坏RNase活性。因此常用于灭活缓冲液和玻璃器皿中的RNase。
抑制RNase的活性：准备溶液时使用无RNase的玻璃器皿、DEPC 处理过的水。180-300℃烘烤玻璃器皿4小时。用DEPC或其他商业化产品处理塑料制品。 尽量使用无RNase的一次性移液器头和微量离心管。在从原包装取出这些小器具时最好使用无菌的镊子！ 在分离RNA的过程中用抑制剂抑制RNase的活性。 实验仪器、材料与试剂
（一）仪器
1. 低温离心机 2. 200℃以上烘箱 3. 琼脂糖凝胶电泳系统 4. 紫外线透射仪 5. 高压灭菌锅 6. 恒温水浴锅 7. 陶瓷研钵
8. 微量移液器 （二）材料
1. 新鲜植物组织
2. 1.5ml Eppendorf 离心管 3. 剪刀、一次性手套等 （一） 试剂
1. Trizol试剂 2. 氯仿 3. 异丙醇 4. 70%乙醇
5. 焦碳酸二乙酯（DEPC） 实验步骤
1. 称取100mg新鲜植物植株，液氮研磨成粉末移入DEPC处理并灭菌的1.5 ml Eppendorf
离心管。
2. 加入1ml Trizol 试剂， 充分混匀。 3. 15~30℃，5min。 4. 4℃，13000rpm,10min。
5. 取上清，加入氯仿200μl，混匀，15~30℃，放置2~5min。 6. 4℃，12000rpm,10min。
7. 取上清移至另一1.5ml Eppendorf 离心管，加预冷的异丙醇500μl，15~30℃，10min 8. 4℃，12000rpm,10min（RNA成胶状）
9. 弃上清，加1ml 75%乙醇（用DEPC 水配制），漩涡器上加一张滤纸涡匀。 10. 4℃，9000rpm,5min。
11. 弃上清，用灭菌枪头超净台吸干，超净台上风吹干5~10min. 12. 用不含RNase的水（DEPC 水）溶解RNA （用枪头反复吸打） 13. 55~65℃，水浴10min(破坏二级结构) 14. -20℃，可以暂存，然后做反转录。
思考题：
1、RNA提取中需要注意的问题有哪些？