40mmol/L β-巯基乙醇≈0.2-0.3%体积的β-巯基乙醇,巯基乙醇用前加) （四）实验步骤
CTAB法小量提取植物基因组DNA
(1) 取少量新鲜叶片，加入200μL的CTAB1提取缓冲液研磨，磨碎后再加入200μL的CTAB1
提取缓冲液，再加入500μL的CTAB2提取缓冲液，混匀，放在65 ℃水浴锅中温育30min（温育过程中要不断的颠倒混匀溶液，动作要轻）； (2) 加入600μL氯仿，均匀混合，动作要轻； (3) 13000r/min轻度离心5分钟；
(4) 取上清，加入等体积的异丙醇，于- 20℃静置30min；
(5) 12000r/min离心10min，弃上清，70%的乙醇洗涤两次，稍干燥，用30μL灭菌的无离子
水溶解（含有RnaseA）。
思考题：植物基因组提取过程中那些操作环节会影响你所提取的DNA的质量和完整性？
实验十二 转基因植物的PCR检测
实验目的
掌握PCR反应的原理及技术。 实验原理
聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）简称PCR技术，是一种体外扩增特异DNA片段的技术。利用PCR技术可在短时间内获得数百万个特异的DNA序列的拷贝。PCR技术在分子克隆、遗传病的基因诊断等方面得到了广泛的应用。
PCR技术实际上是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。反应分为三步：1变性：在高温条件下，DNA双链解离形成单链DNA；2退火：当温度突然降低时引物与其互补的模板在局部形成杂交链；3延伸：在DNA聚合酶、dNTPs和Mg2+存在的条件下，聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应。以上三步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，几十个循环之后，介于两个引物之间的特异性DNA片段得到了大量复制，数量可达到~10
6~7
个拷贝。
PCR技术的参数主要有7个：聚合酶、引物、dNTPs、反应buffer、二价离子、模板、
一价离子。
实验仪器、材料与试剂
（一）仪器
1. DNA扩增仪（PCR仪） 2. 台式离心机 3. 微量取液器 4. 硅烷化的PCR小管 5. 琼脂糖凝胶电泳系统 （二）材料
模板DNA
（三）试剂
1. 10×PCR buffer
2. 4种dNTP混合物：每种10mmol/L 3. Taq DNA聚合酶：5u/μl 4. 引物1和2：10μmol/L
5. 琼脂糖凝胶电泳试剂
实验步骤
1. 在0.2ml Eppendorf管内依次混匀下列试剂，配制50μl反应体系。
ddH2O
10×PCR buffer（含MgCl2） dNTPs（10mM） 引物1 (10uM) 引物2 (10uM) 模板DNA
Taq DNA 聚合酶（5u/ul） Total Volume
2. 按下述循环程序进行扩增
94℃ 3分钟，1个循环；
40.8 ul 5 ul 1 1 1 1
ul ul ul ul
0.2 ul 50
ul
94℃ 30秒，52℃ 30秒，72℃ 50秒，30个循环； 72℃ 延伸10 分钟。 4℃保温。
3. 扩增结束后取15μl扩增产物利用琼脂糖电泳检测扩增情况及PCR产物的长度。
实验十 β-葡萄糖醛酸糖苷酶（GUS）组织化学染色检测转基因植物
实验目的
学习GUS组织化学染色的方法，掌握染色的原理。 实验原理
β-葡萄糖醛酸糖苷酶（GUS）基因是植物转基因中常用的一个报告基因。GUS基因是从
大肠杆菌中分离出来的，在GUS基因附近插入启动子区就产生了转录融合基因或翻译融合基因。在稳定转化的植物中，利用一个简单的组织化学检测就可以精确地分析GUS融合基因的时空表达模式。用X-gluc（5-溴-4-氯-3-吲哚葡糖苷酸）作为底物可以精确地进行活体GUS活性的定位。这一反应分两步进行：首先是切割葡糖醛酸部分，产生无色的吲哚氧基中间产物，随后吲哚氧基中间产物氧化成为不溶的蓝色沉淀。
用GUS进行这些实验有如下优点：1）大多数植物组织中GUS活性的本底低；2）反应产物不扩散，在表达基因的植物细胞内积累；3）通过简单的扩散或真空渗入，底物易被植物细胞吸收。当然，也存在一些缺点：1）虽然非致死检测的研究取得了一些进展，但这一检测对于活体组织仍然不太合适；2）由于酶和产物非常稳定，因而不能真实地反映出GUS替代的那个蛋白在稳定状态下的丰度；3）在GUS表达水平很高的组织中会发生无色反应中间产物渗漏的现象，但是这可以通过在底物溶液中加入氧化剂高铁氰化钾或亚铁氰化钾或者二者都加来使这种渗漏减至最少；4）同所有的组织化学方法一样，其检测结果不是定量的。 用于GUS染色的植物材料的制备方法因涉及的特定组织和器官的不同而异。例如拟南芥的根、花和叶片可以不做任何处理直接染色。但是像烟草和马铃薯这些植物的茎和叶在染色
前必须切成薄片。有时特别是当操作大的组织样品时真空渗入法会有所帮助。 实验仪器、材料与试剂 （一）仪器
真空泵，37℃温箱 （三） 材料
转GUS基因的烟草叶片 （三） 试剂
1．200mmol/l 磷酸钠缓冲液
A液：称NaH2PO4.2H2O 3.12g，定容100 ml水中。
B液：称 Na2HPO4.12 H2O 7.17g，定容100 ml水中。 取39 ml A液、61ml B液混匀
2． X-gluc母液：称取10mg X-gluc，溶于400μl的N，N-二甲基甲酰胺（DMF，C3H7NO），得到25㎎/ ml 的 X-gluc母液，-20℃保存。 3．X-gluc反应液：
缓冲液：100mmol/l 磷酸钠缓冲液中含有0.1 mmol/l K3[Fe(CN)6]、0.1 mmol/l K4[Fe(CN)6].3H2O、10mmol/L EDTA （10ml体积的配制方法:
Na2EDTA (100mM) 1ml 终浓度10mM; K3Fe(CN)6 (0.1M) 0.5ml终浓度5mM K4Fe(CN)6 (0.1M) 0.5ml终浓度5mM; Na2HPO4 (0.2M) 3.1ml终浓度100mM NaH2PO4 (0.2M) 1.9ml终浓度100mM X-Gluc 200ul终浓度0.5㎎/ ml 加H2O 2.8ml 4．70% 乙醇 实验步骤
1．将阴性对照材料和转GUS基因或带有可表达的GUS基因的烟草叶片切成小块，浸入盛有
100μl染色液的0.5ml的离心管中。 2．抽真空后37℃温育4-16h。
3．叶片等绿色材料转入70%乙醇中脱色2-3次，至阴性材料呈白色。 4．肉眼或显微镜下观察，白色背景上的蓝色小点即为GUS表达位点。 5．组织可在70%乙醇中保存数日。
思考题：
1、PCR操作过程中应特别注意哪些环节？
2、PCR循环扩增程序中以下各个环节的作用是什么？
94℃ 3分钟，1个循环；
实验三思考题：
在进行琼脂糖电泳操作过程中，应注意采取哪些保护措施防止溴乙啶污染？ 实验四思考题：
琼脂糖凝胶中回收DNA产物操作过程中应特别注意哪些操作环节？ 实验六思考题：
在感受态制备过程中，影响感受态活性的主要因素有哪些？ 实际操作过程中通常采取哪些措施避免这些不利影响？ 实验七思考题： 1、质粒转化的机理？
2、影响转化效果的主要因素有哪些？ 实验八、九思考题：
1、碱裂解法提质粒过程中，溶液的作用是什么？氯仿的作用是什么？ 2、质粒酶切操作时质粒的用量与什么因素相关？
实验十一思考题：植物基因组提取过程中那些操作环节会影响你所提取的DNA的质量和完整性？
实验十二思考题：
1、PCR操作过程中应特别注意哪些环节？
2、PCR循环扩增程序中以下各个环节的作用是什么？
94℃ 3分钟，1个循环；
94℃ 30秒，52℃ 30秒，72℃ 50秒，30个循环； 72℃ 延伸10 分钟。 4℃保温。
94℃ 30秒，52℃ 30秒，72℃ 50秒，30个循环； 72℃ 延伸10 分钟。 4℃保温。