5mol/L Kac 60ml 冰醋酸 11.5ml
水 28.5ml
配制成的溶液Ⅲ含3 mol/L钾盐、5 mol/L醋酸（pH 4.8）。
5. 氨苄青霉素（Amp） 50mg/ml，置-20℃冰箱保存备用。
胰RNA酶的处理： 将胰RNA酶（RNA酶A）溶于10mmol/L Tris-Cl (pH7.5)、15 mmol/L NaCl中，配成10mg/ml的浓度，于100℃加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20℃。
6. TE缓冲液 含20ug/ml Rnase A。（每1ml DDW中加10mg/ml Rnase A 母液 2ul） 7. Tris-Cl(pH8.0)饱和酚，氯仿，异丙醇或无水乙醇，70%乙醇 8. 限制性内切酶 EcoRⅠ，Xba I 实验步骤
（一）质粒的提取
1. 取实验七培养获得的平板，用灭菌的牙签挑取白斑单菌落（已连入外源基因片段的重
组质粒）放入5ml LB液体培养基（含Amp）中，（用灭菌封口纸封闭试管口）37℃振荡培养过夜。
2. 将过夜培养的菌液(每次按<1.5 ml菌液)倒入Eppendorf管中，10,000rpm离心1min，
去掉上清液，重复前述过程，收集菌体3次，沉淀悬于100μl 溶液I 中,涡旋使充分悬浮。
3. 加入200μl 溶液II,混匀，冰浴5min（冰浴环节可省略）。 4. 加入150μl 溶液III,混匀，冰浴5min（冰浴环节可省略）。 5. 4℃，12,000rpm离心5min，将上清移至1个新Eppendorf管中。
6. 加入等体积酚：氯仿：异戊醇（V/V,25﹕24﹕1），混匀，4℃，12,000rpm离心15min，
取上清液。
7. 重复步骤6操作过程
8. 上清液中加入预冷的等体积异丙醇或2.5×体积的无水乙醇，-20℃沉淀30min-2h。 9. 12,000rpm离心15min。
10. 倒掉上清，沉淀加入500μl 70%乙醇洗涤2次。
11. 12,000rpm离心3分钟，去掉上清。室温或真空干燥沉淀。 12. 每管中加入30μlTE缓冲液,37℃溶解质粒DNA。
（二）质粒酶切
在0.5mlEp管中调制酶切体系如下: 在20μl反应体系中，
加入无菌水12μl， 10×Buffer H 2μl,
20μl
Sac I 0.5μl, Xba I 0.5μl,
质粒5μl。
在对照酶切体系中不加限制性内切酶，其余与上述体系相同，用水补足体积。37℃酶切2-3小时，琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。
思考题：
1、碱裂解法提质粒过程中，溶液的作用是什么？氯仿的作用是什么？ 2、质粒酶切操作时质粒的用量与什么因素相关？
实验十 渗透法转化拟南芥及转化子筛选
实验目的
学习渗透法转化拟南芥的方法及筛选转化子的方法。 实验仪器、材料和试剂 （一）仪器 1. 恒温摇床 2. 微量取液器 （二）材料
1. 农杆菌（含带有外源基因的质粒） 2. 拟南芥（已经开花） （五） 试剂
1. 利福平 34 mg/ml 2. 卡那霉素 10mg/ml 3. LB液体培养基
4. 农杆菌渗透培养基：1/2×MS，5 %蔗糖，0.5g MES/L，1mg/mL的6-BA母液10μL/L，Silwet L-77 200μL/L，pH5.7 5. 0.1%琼脂
6. 固体筛选培养基：1×MS salt，1%蔗糖，pH0.8，0.8%琼脂，pH5.7，卡那霉素30mg/l 7. 70%乙醇 8. NaClO溶液 9. 无菌水 实验步骤
1. 植物的生长
拟南芥种子播种于盛满培养土的直径7cm的培养杯中，用一纱网覆盖，萌发2-3天后移至4℃光照培养箱中放置一周（进行春化），再放到21℃的组织培养室中生长。
植株长出的花序其下部的花出现授粉现象时（通常说的开花时）进行转化。转化前，将已授粉花及荚果除掉。 2. 菌液的准备
挑取鉴定好的农杆菌单克隆放于20ml含有100mg/L利福平、50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，28℃，250rpm震荡培养至OD600为0.5左右。在转化前一天，转入含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基的大瓶中培养过夜。第二天，当菌液OD600在1.2-1.6之间时取出使用。 3. 渗透转化
制备好已转化了外源基因（此处是带有yAP1基因）植物表达载体质粒的农杆菌菌液100mL，室温5,000rpm离心15分钟，弃上清，沉淀悬浮于相应体积的渗透培养基（1/2×MS，5 %蔗糖，0.5g MES/L，1mg/mL的6-BA母液10μL/L， Silwet L-77 200μL/L，pH5.7）中，重悬后的菌液OD600值在0.8左右。
将农杆菌悬浮液倒在小烧杯中，将长有拟南芥的培养杯倒扣其上，保证莲座叶以上部分浸没于液体中，浸泡15分钟，取出植株（或用吸管吸取重悬的菌液逐一滴在开放的拟南芥花朵上）。农杆菌悬浮液浸染的植株横放在塑料盘中，用保鲜膜封好以保持湿度，放在恒温室培养。第二天打开，竖直培养，仍用保鲜膜保持湿度3-4天。根据情况可再对开放的拟南芥花朵连续浸染多次。
培养三至四周，待种子成熟后，收取种子，干燥器中存放2周，4℃春化约一周。 4. 转化子的筛选
种子消毒：先用70%的乙醇浸泡2分钟，再用1%(体积比)NaClO溶液涡旋洗涤15分钟，无菌水漂洗5-6次，用0.1%的琼脂重悬浮种子，均匀分散到固体筛选培养基( 1×MS
salt，1%蔗糖，pH0.8，0.8%琼脂，pH5.7，卡那霉素30mg/l)表面上，4℃春化一周，放入恒温组织培养室培养。大约两周后，即可区分转化株与未转化株在含卡那霉素的培养基上黄化），（保持绿色的）转化株移栽到土中以收取T1代种子。
实验十一 植物基因组DNA的提取
实验目的
掌握提取植物基因组DNA的原理，学习从植物组织中提取基因组DNA的方法。 实验原理
1、核酸的理化性质
? DNA则为白色类似石棉样的纤维状物。核酸和核苷酸 大都呈酸味（除肌苷酸、鸟
苷酸具有鲜味外）。DNA、RNA和核苷酸都微溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂。DNA钠盐在水中为10g/L，呈黏性胶体溶液。 RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。DNA溶液的粘度很大，而RNA溶液的粘度小得多。核酸发生变性或降解后其粘度降低。 核酸受到强大离心力的作用时，可从溶液中沉降下来，其沉降速度与核酸的大小和密度有关。
? 核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞中都是以与蛋白质结合的状态存在，用DNP
和RNP 表示；DNP和RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响而不同。DNP在低浓度盐溶液中，几乎不溶解，如在0.14 mol/L的氯化钠溶解度最低，仅为在水中
溶解度的1%，随着盐浓度的增加溶解度也增加，至1mol/L氯化钠中的溶解度很大，比纯水高2倍。RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小，在0.14mol/L氯化钠中溶解度较大。因此，在提取时，常用此法分离这两种核蛋白。
植物DNA的提取程序应包括以下几项：首先，必须破碎（或消化）细胞壁释放出细胞内容物。然而许多操作在破壁的同时也会剪切DNA，因此任何方法都是在DNA的完整性和产量这两个方面之间折衷考虑的结果。分离总基因组DNA常用的破壁方法是将植物组织胀水，然后研磨成细粉；或者将新鲜植物组织在干冰或液氮中快速冷冻后，再用研钵将其磨
成粉。分离核DNA或细胞器DNA时则应采取更为温和的破壁方法，以免过早破坏
内膜系统，人们通常采用在含有渗透剂的缓冲液中4℃匀浆的方法来破壁。
其次，必须破坏细胞膜使DNA释放到提取缓冲液中。这一步骤通常靠诸如SDS或CTAB一类的去污剂来完成。去污剂还可以保护DNA免受内源核酸酶的降解。通常提取缓冲液中还包含EDTA，它可以螯合大多数核酸酶所需的辅助因子——镁离子。
最后，一旦DNA释放出来，实验过程中对其破坏的程度必须要降到最低，避免剧烈振荡或小孔Tip头快速抽吸溶液中的DNA。一般说来，如果操作得当，可以得到相对分子质量长度为50-100kd的DNA。
因为在DNA粗提物中往往含有大量RNA、蛋白质、多糖、丹宁和色素等杂质，这些杂质有时很难从DNA中除去。大多数蛋白可通过氯仿或苯酚处理后变性、沉淀除去，绝大部分RNA则可通过RNase A处理过后除去。但多糖类杂质一般比较难除去，此类杂质过多时，常常使提取物呈胶状，更为重要的是即使是低浓度情况下它们也会干扰后续操作，如抑制某些DNA修饰酶包括限制性内切酶的活性，从而阻碍Southern杂交或基因克隆；同时多糖杂质还会影响吸光度对核酸的定量分析等。 方法 一
实验仪器、材料与试剂 （一）仪器
1. 研钵
2. 高速台式离心机 3. 微量取液器 4. 恒温箱
5. 琼脂糖凝胶电泳系统 （二）材料
转基因拟南芥
（三）试剂
试剂：CTAB1提取液（50mmol/L Tris- HCl pH 8.0，10 mmol/L EDTA， 0.7 mol/L NaCl） CTAB2提取液(50mmol/L Tris- HCl pH 8.0，10 mmol/L EDTA， 0.7 mol/L NaCl， 2%CTAB，